【摘要】 目的 研究BRCA1基因在散发性乳腺癌中的突变情况，探讨BRCA1基因突变与乳腺癌的关系。 方法 应用PCRSSCP（singlestrand conformation polymorphism analysis）分析和DNA直接测序法，检测65例散发性乳腺癌BRCA1第2，3，5，8，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20和21外显子基因突变情况。 结果 65例中共检测出4例突变，其中1例为5外显子的错义突变( 287 A>T)，1例为12外显子的错义突变(4 285 G>A)，1例为17外显子的错义突变(5 115 T>C)，1例为18外显子的错义突变(5 206 T>A)。乳腺癌BRCA1的基因突变率为6.2 %(4/65)。结论 BRCA1基因突变与散发性乳腺癌有密切关系。

【关键词】 乳腺癌； BRCA1基因； PCR; SSCP； DNA序列分析

基金项目：广西自然科学基金资助项目（桂科自0007029）
Mutational Screening of BRCA1 in Breast Cancer Patients

ZHANG Haitian, LU Yunfei, ZENG Jian, LIAO Qinghua, LIN Jian

Department of Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, ChinaAbstract：Objective To screen BRCA1 gene mutation in sporadic breast cancer. Methods Mutational screening on fragments of exon 2, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21 of BRCA1 gene in 65 cases of sporadic breast cancer was performed by PCRSSCP（ singlestrand conformation polymorphism analysis), and alterations were confirmed by DNA sequencing. Results A total of 4 single nucleotide changes in BRCA1 were identified, including 1 missense mutations in exon 5 (287 A>T), 1 missense mutation in exon 12(4 285 G>A), 1 missense mutations in exon 17(5 115 T>C), and 1 missense mutations in exon 18(5 206 T>A ), the mutation rate was 6.2%(4/65). Conclusion Mutations in BRCA1 is closely related to sporadic breast cancer.

Key words： BRCA1 mutation; Breast cancer; PCR; SSCP; DNA sequencing

BRCA1是迄今发现与乳腺癌发生最重要的易感基因之一，定位于人17q21，编码1863个氨基酸的蛋白质。BRCA1在调节细胞周期进程、DNA损伤修复、细胞生长与凋亡及转录活化与抑制等多种生物学途径都起重要作用［1］。BRCA1还是某些特异靶基因的转录调控子［2］。BRCA1突变会导致细胞基因组不稳定，对环境变化的敏感性增加［1,3］。近年来，国内对乳腺癌BRCA1基因进行了一些研究，但多数作者只对BRCA1的部分外显子的部分序列进行研究，发现突变点有很大差异，没有发现突变热点。我们应用PCRSSCP技术检测BRCA1基因15个外显子的突变，并对检测出的可疑突变进行DNA测序，探讨乳腺癌BRCA1基因突变的特点，为乳腺癌的早期诊断及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本

收集我科2000～2003年进行全乳切除手术的65例女性乳腺癌病人标本, 对每例病人均收集血液和癌组织标本作对照，年龄35～70岁。标本在-20℃低温冰箱保存。

1.2 DNA提取

每例标本取冰冻组织0.5 g捣碎，常规酚、氯仿法抽提DNA。用紫外分光光度计测定所提取DNA的浓度及纯度后，4℃贮存。

1.3 PCR扩增

根据文献报道BRCA1的DNA序列设计引物，见表1。

将各引物(也是用作测序的引物)配成0.1 g/L浓度，置于Eppendorf管中备用。PCR反应体系的总体积为11 μL，含反应液10 μL， DNA模板0.5 μL， 引物1.0 μL， Taq酶0.5 U。PCR反应在PCR反应仪上进行，热循环参数如下：95℃变性2 min后进入主循环。94℃变性30 s，55℃～60℃复温30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。PCR产物由1.5%琼表1 扩增BRCA1各外显子的引物序列脂糖凝胶电泳检测。

1.4 SSCP分析

取PCR产物0.1 μg和上样缓冲液4 μL，98℃变性3min后置冰浴中骤冷，上样于10×10cm面积的12%聚丙烯酰胺凝胶中，恒压300V，3～6h。分别采用最适电泳温度。电泳结束后，银染观察。

1.5 DNA序列测定

凡ＳＳＣＰ分析出现异常区带者，相应的ＤＮＡ用同样的引物再次扩增，再次用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测和再次进行SSCP分析，再次SSCP分析仍出现异常区带者，送出进行DNA测序。

2 结果

2.1 ＰＣＲ扩增

65例乳腺癌患者血液和癌组织标本BRCA1的15个外显子ＰＣＲ扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带，与DNA Marker所提供的片段定位相同，说明患者ＢＲＣＡ1基因在所检测的片断上没有明显的插入或缺失。

2.2 ＳＳＣＰ分析

65例乳腺癌中，有4例患者癌组织ＢＲＣＡ1基因的SSCP分析出现异常区带，这些异常区带分别出现在5、12、17和18等外显子中，见图1。对应的血液均未发现有异常区带。

2.3 ＤＮＡ序列分析

对SSCP分析时出现异常区带者的ＰＣＲ产物直接进行DNA测序，结果显示：

① 1例5Exon第287位碱基上“A”被“T”取代，从而使第56位密码子编码的赖氨酸被天酰氨酸替代，为错义突变。

②1例12Exon第4285位碱基上“G”被“A”取

图1 12 Exon SSCP结果，左起第3泳道可见异常区带

代，从而使第1389位密码子编码的丝氨酸被天酰氨酸替代，为错义突变。

③1例17Exon第5115位碱基上“T”被“C”取代，从而使第1666位密码子编码的酪氨酸被组氨酸替代，为错义突变。

④1例18Exon第5206位碱基上“T”被“A”取代，从而使第1696位密码子编码的缬氨酸被谷氨酸替代，为错义突变，见图2～5。

图2 5exon 287 AAA→AAT and codon 56 Lys→Asn

3 讨论

上世纪80年代，人们已发现一些乳腺癌患者呈现家族聚集现象，而且连锁分析（Linkage analysis）方法可以找出可能致癌染色体。虽然BRCA1基因编码的蛋白质的功能到目前为止还不是很清楚，但已经有临床研究表明BRCA1突变携带者的乳腺癌的预后较非BRCA1突变携带者差[4]。近来研究发现，作为一种抑癌基因，与同骨肉瘤的恶化有密切关系[5] 。

近十年来一些学者对家族性和非家族性乳腺癌患者的BRCA1基因的研究发现，多形式的基因突变可发生于BRCA1基因的整个编码区，种类超过1 000多种，并没有明显的热点形成。冰岛、瑞典和非洲妇女早发性乳腺癌的人群中检出了较高的BRCA1突变率［6］。BRCA1突变的种类及频率可能与地域、人种有关。国内对BRCA1的研究起步较晚，1996年才出现有关BRCA1的研究报告。国内学者对乳腺癌组织DNA的BRCA1基因的研究绝大多数都集中在第2，11和20外显子上［711 ］。丁晓曼等[11]研究了10例早发性乳腺癌患者BRCA1外显子2、11和20的基因突变情况，结果发现第3732位碱基“G”被“C”取代，而使密码子1205编码的甘氨酸被精氨酸取代，并指出BRCA1基因突变并不局限在有卵巢癌或乳腺癌家族史的妇女，不能单纯根据家族史来判断有无BRCA1基因突变。国内学者对散发性乳腺癌BRCA1突变率的研究结果也很不一致。即使对BRCA1基因中相同的第2、11和20外显子进行检测，赖春宁等［7］对38例散发乳腺癌患者血中DNA的BRCA1基因突变检测，突变率为10.5%(4/38)。而崔静和董秋明［8,10］分别对79例和34例乳腺癌进行2，11和20外显子检测，仅发现2430位点的多态性，有害突变率为0。由于国内对BRCA1研究较少，而且没有对BRCA1基因的编码外显子的全部序列进行检测，以及检测的方法学上可能存在不足［9］，因此目前国内BRCA1基因研究与国外相比存在较大的差距，值得进行进一步研究。

我们根据文献提供的BRCA1基因碱基系列，选择2，20外显子以及国内研究较少的3，5，8，10，12，13，14，15，16，17，18，19和21外显子各设计一对引物，应用PCRSSCP方法筛选和DNA直接测序法，检测乳腺癌患者BRCA1基因外显子突变及突变位置，将检测结果与Gene Bank中野生型BRCA1基因比较。结果显示，65例乳腺癌患者中，有4例患者发生基因突变，分别在第5，12，17和18外显子上，均为错义突变。本研究发现的4例突变国内未见相同报道，与国外报告也不尽相同。文献报道突变率较高的第2、20外显子,我们未检测出突变基因。由于广西是少数民族聚集区，本研究没有对BRCA1全部外显子进行检测，这是否能够认为广西乳腺癌患者BRCA1基因突变形式有别于其他群体，尚需进一步证实。

【参考文献】
［1］ Scully R, Livingston DM. In search of the tumoursuppress