【摘要】 目的 研究乳腺癌组织中细胞周期蛋白D2（cyclinD2 ）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclindependent kinase 4, CDK4）的表达，探讨它们与p27kip1蛋白表达、与临床病理指标的关系及其预后意义。方法 应用免疫组化SP法，检测96例乳腺癌、18例癌旁正常乳腺组织石蜡切片中cyclinD2、 CDK4的表达，比较它们与p27kip1蛋白表达、与临床病理学指标之间的关系。结果 ①96例乳腺癌组织中cyclinD2、CDK4和p27kip1的表达率分别为41.7%、54.2%和38.5%，与正常乳腺组织相比有显著性差异 (P＜0.001)。②cyclinD2、CDK4的表达与乳腺癌的组织学分级，核分裂数有关(P＜0.001)，和局部复发有关(P＜0.05)，而与患者年龄、肿瘤大小、组织类型无关(P＞0.05),CDK4的表达与乳腺癌的淋巴结转移，雌激素受体状态也有密切关系 (P＜0.01)。③p27kip1的表达缺失，与肿瘤大小、组织学分级，核分裂数，有无淋巴结转移以及局部复发均有关系（P＜0.05)，而且p27kip1的表达与cyclinD2、CDK4的表达呈显著负相关(P＜0.01)。结论 cyclinD2和CDK4的表达与乳腺癌的发生、发展有关，而p27kip1的表达缺失和CDK4的异常表达与乳腺癌的侵袭、转移及复发有关，可作为判断乳腺癌生物学行为和预后的重要指标。

【关键词】 乳腺肿瘤；细胞周期蛋白D2；细胞周期蛋白依赖性激酶；p27kip1基因蛋白；免疫组织化学；预后

Clinical Significance and Expression of cyclin D2, CDK4 in Human Breast Carcinoma

JIN Dongling,SHI Zhimin,TIAN Ke

Department of Pathology, College of Medicine, Hebei University of Engineering, Handan 056029,ChinaAbstract：Objective To investigate the expression level of cyclinD2 and CDK4 protein in breast carcinoma, and their relationship to p27kip1 protein and clinicopathological factors as well as the prognostic factors in breast carcinoma. Methods The SP immunohistochemical technique was used to detect the expressions of cyclinD2, CDK4 and p27kip1 in 96 cases of breast carcinoma and 18 cases of adjacent nontumor normal breast tissue.The relationship between cyclinD2, CDK4 to p27kip1 protein expression and clinicopathological factors were analyzed.Results ①The positive expressions of cyclinD2,CDK4 and p27kip1 protein in 96 cases of breast carcinoma were41.7%,54.2% and 38.5% respectively.There was a significant difference between carcinoma and normal breast tissue (P＜0.001).②The expression level of both cyclinD2, and CDK4 protein in breast carcinoma was significantly associated with histological classification,mitotic index, and local recurrence(P＜0.05), and little associated with age, tumor size and histological type(P＞0.05).The expression level of CDK4 in breast carcinoma was related to Lymph node metastases and ER status(P＜0.01).③The loss of p27kip1 protein expression in breast carcinoma was significantly associated with tumor size, histological classification, mitotic index, Lymph node metastases and local recurrence(P＜0.05),There was a negative correlation between p27kip1 and cyclinD2 as well as CDK4 expression in breast carcinoma(P＜0.01).Conclusion The expression of cyclinD2 and CDK4 protein may play a important role in the carcinogenesis and progression of breast carcinoma.The loss p27kip1 expression and overexpressed CDK4 was associated with the invasion,metastases and local recurrence, and may be as the indications of biological behavior and prognosis of breast carcinoma.

Key words：Breast neoplasms;cyclinD2;CDK4;p27kip1;Immunohistochemistry;Prognosis

最近研究表明，肿瘤是一类细胞周期疾病，细胞周期的调控异常导致细胞的失控性增殖，是肿瘤发生和发展的重要特征［1］。细胞周期依赖性激酶（cyclindependent Kinese,CDKs）是细胞周期最核心的调控因子，其与细胞周期蛋白（cyclins）的结合导致CDKs活化，从而促进细胞从G0/G1期向S期的转化［2］。p27kip1为细胞周期抑制蛋白，可竞争性结合CDKs使之失活，从而阻止G1/S期转化［3，4］。本研究应用免疫组织化学方法，对细胞周期的正相调节因子CDK4，cyclinD2和负相调节因子p27kip1在乳腺癌中的表达进行检测，探讨其与临床病理指标的关系及意义。

1 资料与方法

1.1 资料 选取1996年1月～2000年12月河北工程学院医学院病理教研室病理检查的乳腺癌标本：取其中病史资料完整，有ER检测结果的病例96例，患者年龄28～76岁，中位年龄51岁。全部病例均为女性，术前均未进行化疗和放疗。标本常规取材，10％甲醛固定，石蜡切片（4μm），常规HE染色，根据WHO乳腺肿瘤组织学分类（2003）标准进行病理分类：导管原位癌10例，小叶原位癌8例，浸润性导管癌63例，浸润性小叶癌12例，黏液癌3例。全部96例中有44例伴腋窝淋巴结转移，11例伴锁骨上淋巴结转移。另外采取癌旁正常乳腺组织18例作为对照组。BloomRichardsen’s组织学分级；参照Elston和Ellis改良方法[5]，对本组96例乳腺癌病例进行分级；其中Ⅰ级47例，Ⅱ级30例，Ⅲ级19例。

1.2 方法 鼠抗人cyclinD2,鼠抗人p27kip1单克隆抗体及即用型SP试剂盒均购自福州迈新公司。兔抗人CDK4购自武汉博士德公司。免疫组化染色SP法。微波抗原修复。免疫组化染色过程按试剂盒说明操作，苏木素衬染。

1.3 结果判定 用已知阳性的肺癌组织为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。三种染色均以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，计数1 000个肿瘤细胞，按阳性细胞所占百分比并参考着色强度确定分级如下：无明显阳性细胞或阳性细胞数＜10％为（-），阳性细胞数≥10%为（+）。

1.4 统计学分析 由河北工程学院医学院卫生统计教研室进行数据处理，采用χ2检验和确切概率法。

2 结果

2.1 三种蛋白在正常乳腺及乳腺癌中的表达 cyclinD2和CDK4在正常乳腺组织不表达，在乳腺癌中表达率分别为41.7％（40/96）和54.2％（52/96）（P=0.0007，P=0.0000）；p27kip1在正常乳腺组织和乳腺癌中阳性表达率分别为100％和38.5％（37/96）（P=0.000）。

2.2 三种蛋白在不同类型乳腺癌中的表达情况 cyclinD2、CDK4、p27kip1在导管原位癌、小叶原位癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌和黏液癌等不同组织学类型中的表达无显著性差异（P=0.385，P=0.462，P=0.752）。

2.3 三种细胞周期调节因子的表达与乳腺癌的临床病理指标的关系 见表1。

2.4 乳腺癌中cyclinD2、CDKs表达与p27kip1的表达之间的关系 cyclinD2、CDK4的表达与p27kip1的表达之间有显著性差异（P＜0.01)，对其进行相关性分析，cyclinD2、CDK4的表达与p27kip1的表达均呈显著负相关（P＜0.01），即cyclinD2与p27kip1，CDK4与p27kip1均为反向表达。

3 讨论

细胞周期调控机制的核心是CDKs的时相性激活，主要的调控点在G1期[6]。调节G1期的细胞周期蛋白cyclinD家族至少包括三种不同的蛋白质D1、D2和D3，它们可分别与CDK4结合导致CDK4活化，进而促进G1/S期的转化[7]。cyclinD1和CyclinE对肿瘤的影响已有很多研究，而cyclinD2在乳腺癌中的研究未见报道。作者在前期对胃癌和肺癌研究的基础上[3,4],对乳腺癌进行了检测，结果发现：cyclinD2和CDK4在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织，其表达和患者的年龄，肿瘤大小及病理组织类型无关，而与乳腺癌的分化程度即组织学分级和核分裂数有密切关系，与肿瘤的复发也有一定关系。说明cyclinD2的过度表达可导致CDK4的激活，从而导致细胞的过度增殖，促使乳腺癌的发生。而且在肿瘤的发展过程中持续发挥作用。这和有关cyclinD1的研究基本一致[8]，但本文结果显示cyclinD2的高表达与乳腺癌组织中的雌激素受体状态无关，与有关cyclinD1的报道不一致，其原因有待进一步探讨。本文对CDK4的检测还显示，CDK4的表达与乳腺癌有无淋巴结转移及雌激素受体状态有关。说明CDK4表达不仅与乳腺癌发生有关，而且在乳腺癌的演进中也发挥重要作用，影响患者的预后。

p27kip1蛋白是细胞周期G1期的负相调控因子，它能抑制cyclinD和CDK4的结合，阻止细胞周期中G1/S期的转换，从而抑制细胞的增殖。本文结果显示，p27kip1在乳腺癌中的表达显著低于正常乳腺组织，而且其表达缺失和肿瘤大小，组织学分级、核分裂数，有无淋巴结转移以及有无局部复发均有密切关系。p27kip1表达缺失表明p27kip1基因在乳腺癌的演进中逐渐丧失了抑癌作用，从而影响乳腺癌的生物学行为，使癌细胞具有更高的恶性程度<