【关键词】 乳腺癌

【摘要】 目的 SPARC是一种从多方面调节细胞功能的细胞外基质蛋白，与组织重建和肿瘤有关。SPARC在多种肿瘤中高表达，本文旨在探讨乳腺癌中SPARC的表达差异。 方法 用半定量逆转录―聚合酶链反应（RT-PCR）分析SPARC在不同的乳腺癌组织和其相邻的正常黏膜组织的差异表达量，希望找出基因表达变化的趋势。采用ELISA法检测正常对照组和乳腺癌患者术前术后血浆中的SPARC水平，希望找出血浆中的SPARC的变化趋势。 结果 RT-PCR分析SPARC在16对配对乳腺癌组织标本中的表达，其中11例的表达明显高于其相应的正常组织，在5例中差异表达不明显，R=68.8%（有差异的例数/总例数）。采用ELISA法检测40例正常人和32例乳腺癌患者术前术后血浆中的SPARC水平。正常人血浆中的SPARC水平为（644±124）ng/ml，乳腺癌患者术前血浆中的SPARC水平为（625±117）ng/ml，正常人和乳腺癌患者术前血浆中的SPARC水平之间差异无显著性（P>0.05），乳腺癌患者术前比术后血浆中的SPARC水平（611±142）ng/ml略高，但两者之间差异无显著性（P>0.05）。 结论 SPARC在乳腺癌组织中的过度表达，为乳腺癌的治疗提供了一个新的可行方向。

关键词 SPARC 乳腺癌 基因表达

The differential expression analysis of SPARC in breast cancer

Che Yiqun，Wang Hai，Qi Jun

Clinical Laboratory of Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College，Beijing100021.

【Abstract】 Objective SPARC（secreted protein，acidic and rich in cysteine）is a matricellular protein with multiple effects on cell behavior.SPARC is overexpressed in many cancers.To investigate the role of SPARC in pro-liferation and metastasis of breast cancer.Methods The differential gene expression between breast cancer and its corresponding normal mucosa were analyzed by RT-PCR.Moreover，the expression of SPARC protein in serum was investigated by ELISA.Results SPARC gene was markedly upregulated in11of16cases compared with the corre-sponding normal breast tissue.The level of SPARC in normal serum was（644±124）ng/ml.The standard of SPARC in breast cancer patients before operations was（625±117）ng/ml.The level of SPARC in normal serum was not sig-nificantly correlated with that in breast cancer patients before operations（P>0.05）.The level of SPARC in breast cancer patients before operations was slightly higher than those after operations（611±142ng/ml），but there were not significant correlation each other（P>0.05）.Conclusion Due to SPARC was overexpressed in breast cancer，it provide a new way to treatment of breast cancer.

Key words SPARC breast cancer gene expression

乳腺癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。北美、北欧是乳腺癌的高发地区，其发病率约为亚、非、拉美地区的4倍。我国虽是乳腺癌的低发地区，但其发病率逐年上升，尤其沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。1995年上海的乳腺癌标化发病率为38/10万，占女性恶性肿瘤发病率中的第1位。在欧美等国，乳腺癌根治术、改良根治术的应用正不断减少，行局部切除手术及放疗的病例已达乳腺癌患者的20%～30%，并同时考虑行乳房重建术。虽然目前国内仍以根治术、改良根治术为主，但随着诊疗水平的提高，早期病例的不断增多和人们对生存质量的要求提高，要求实验室为术后治疗及估计预后提供更多的参考数据。近年来随着癌基因研究的不断深入，发现了不少与乳腺癌的诊治和预后有关的基因。我们通过前期微阵列技术发现SPARC在多种肿瘤中呈上调表达。所以本文就SPARC在乳腺癌组织和血浆中的表达做一分析。SPARC（secreted protein，acidic and rich in cysteine），即富含半胱氨酸（Cys）的酸性蛋白，又称作骨连接蛋白（os-teonectin）、基底膜-40（BM-40）、43k蛋白 ［1］ ，最初是作为人和牛骨主要的非胶原成分于1981年被Termine等描述和纯化的，其cDNA最先是从基质中分化的鼠胚胎瘤细胞的基因文库中分离出来的。1987年Mann等通过对cDNA序列的比较，证实骨连接蛋白、BM-40和43k蛋白是一种分子或种间同系物。人SPARC位于染色体5q31-33 ［2］ 。SPARC由纤维原细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞和血小板等产生 ［3，4］。

1 对象与方法

1.1 研究对象 24例配对的乳腺癌手术标本，皆由中国医学科学院肿瘤医院取材，均取材于2003年3～11月的乳腺癌手术患者，每一例标本离体后，立即做好标记置液氮中，然后放入-80℃超低温冰箱贮存。32例血浆标本来源于中国医学科学院肿瘤医院2003年7～12月初诊患者，均未行放化疗或其他针对肿瘤的治疗，术后标本为手术后7～14天采集（由于出院时间限制）。对照组40例来自健康查体检测指标正常者，血浆置于-80℃超低温冰箱贮存。

1.2 试剂和仪器 Trizol（GIBCO公司），Taq DNA聚合酶（GIBCO公司），RNase inhibitor RNA酶抑制剂（PROMEGA公司），dNTPs（TAKARA公司），pUC Mix Marker8（MBI Fermentas公司），SPARC ELISA Kit（Haematologic Technologies Inc.）。9600PCR扩增仪（PERKIN ELMER），凝胶成像扫描仪（Bio-Rad），洗板机（Bio-Rad），酶标仪（Anthos公司）。

1.3 引物 运用Primer3软件（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi），初步设计出所需引物，再通过同源性比较分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），确定其特异性，进一步通过BLAST分析，确定每个引物对中的两个引物是否分别来自不同的2个外显子（这样会去除DNA污染）。管家基因β-actin RT-PCR引物，产物212bp，上游引物序列为5'-GGCTACAGCTTCAC-CACCAC-3';下游引物序列为5'-AGGAAGGAAGGCTG-GAAGAG-3'。SPARC的RT-PCR引物，产物406bp。上游引物序列为5'-TCGCCTGAGGCTGTAACTGA-3';下游引物序列为5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'。由上海博亚公司合成。

1.4 RT-PCR cDNA合成:4μl5×反转录酶缓冲液（250mM Tris-HCl pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl 2 ，50mM DTT），1μl dNTPs（每种10mM），1μl RNasin（40u/μl），1μl ScriptⅡ反转录酶（10u/μl），用DEPC水补足体积至20μl。扩增目的基因SPARC时，其内参照用管家基因β-actin。PCR反应体系为:10×Buffer2.5μl，25μM dNTP2.5μl，25μM MgCl 2 1.5μl，10μM SPARC上游引物1μl，10μM下游引物1μl，Taq酶0.2μl，cDNA1μl，蒸馏水15.3μl;其PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共27个循环，然后72℃延伸10min。

1.5 图像和数据分析 RT-PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳条带图像采用Multi-Analytist显像系统（Bio-Rad公司）成像扫描仪扫描成TIFF格式的文件，以正常与肿瘤的目的基因与内参照管家基因原始光密度值的比值来判断SPARC mRNA表达的相对变化。

1.6 统计学方法 采用配对t检验，借助SPSS11.5软件完成，P<0.05为差异有显著性。

1.7 血清学检测 采用竞争酶联免疫吸附技术，由液相SPARC和结合于单克隆抗体的SPARC与生物素结合物竞争。将标准品做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64稀释，此6个标准量和原液均做双孔测定。检测限16～1000ng/ml;批间差异CV≤10%;批内差异CV≤7%;回收率（血浆）90%～110%。

2 结果

2.1 SPARC基因的RT-PCR检测结果 RT-PCR分析SPARC在16对配对标本中的表达，在其中11例乳腺癌组织中的表达明显高于其相应的正常黏膜组织，在5例中差异表达不明显，R=68.8%（有差异的例数/总例数）。部分标本的SPARC基因的RT-PCR检测结果见图1。注:M:DNA分子量标记;N:正常组织;T:乳腺癌组织;内对照:β-actin

图1 SPARC基因的半定量RT-PCR结果 2.2 血浆中SPARC水平 见图2、图3。

图2 血浆中SPARC标准含量的对数与吸光度之间的标准曲线

图3 血浆中SPARC在乳腺癌患者术前术后

及正常对照组三者之间的比较 采用ELISA法检测40例正常人和32例乳腺癌患者术前术后血浆中的SPARC水平，正常人血浆中的SPARC水平为（644±124）ng/ml。乳腺癌患者术前血浆中的SPARC水平为（625±117）ng/ml。二者差异无显著性，P>0.05。乳腺癌患者术后血浆中的SPARC水平为（611±142）ng/ml。乳腺癌患者血浆中的SPARC水平术前术后之间差异无显著性，P>0.05。

3 讨论

SPARC是结合于细胞和细胞外基质的生物活性糖蛋白，与某些基质成分、生长因子和细胞因子作用，参与着组织重建、形态生成、细胞迁移和增殖，调节机体的生理和病理过程。它能在多种组织细胞中表达，尤其在那些正在发育和重建的组织中 ［5］ 。SPARC有三个结构区，分别调节细胞黏附、增殖和基质合成。根据细胞外的环境细胞外蛋白酶快速水解蛋白SPARC。在人类正常的甾体细胞、软骨细胞、胎盘滋养层<