【摘要】 目的 探讨乳腺癌中细胞外信号调节激酶磷酸化表达及其意义。方法 采用免疫组织化学和Western blot技术检测乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、原发性乳腺癌病灶中磷酸化细胞外信号调节激酶-2(extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2)表达情况。结果 免疫组化检测在乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌中磷酸化ERK2蛋白阳性率分别为38.10%(8/21)、66.67%(14/21)、87.50%(84/96)，磷酸化ERK2蛋白表达在三种疾病之间有统计学意义(χ2=25.044，P=0.000)；Western blot技术检测乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺原位癌、乳腺浸润性癌中磷酸化ERK2蛋白表达的平均OD值分别为0.655、0.818、0.882、0.933，乳腺癌中磷酸化ERK2表达量明显高于良性病变，结果与免疫组化检测结果一致；乳腺癌ERK2蛋白表达情况在不同年龄段有统计学意义(χ2=5.677，P=0.017)；乳腺癌ERK2蛋白表达与乳腺癌病理组织学类型、临床分期、生存率无显著相关性。结论 在乳腺癌中ERK2磷酸化增强与癌细胞生长活性增加有关，ERK2在判断乳腺良恶性疾病时具有辅助价值。

【关键词】 乳腺癌；细胞外信号调节激酶；Western blot；免疫组化

Expression of Phosphorylated Extracellular Signal-Regulated Kinase and its Clinical Significance in Patients with Breast Cancer

(Dept. of Pathology，the Affiliated Hospital of Ningxia Med.Coll.，Yinchuan 750004)

Abstract：Objective To investigate the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase 2 (p-ERK2)，to reveal the correlation between their expression and clinical-pahtology parameters of breast cancer and to analyze the effect on the pathogenesis and progression of breast cancer. Methods The data of clinic and pathology in 21 cases with adenosis of breast，21 cases with fibroadenoma of breast，and 96 cases with breast caner was respectively collected. All specimens were detected by histopathology，immunohistochemistry technique with antibodies against p-ERK2. The correlation of these factors was analysed. 12 cases of every disease were collected. All every fresh specimens were evaluated by Western blot technique with antibodies against of p-ERK2. Results The positive rate of p-ERK2 expression in adenosis，fibroadenoma and carcinoma of breast was 38.10%(8/21)，66.67%(14/21) and 87.50%(84/96)，respectively. There was statistical significance between p-ERK2-positive and p-ERK2-negative patients in these diseases (χ2=25.044，P=0.000). The ratio of the average OD value of the p-ERK2 expression detected by Western blot technique in adenosis，fibroadenoma，duct cancer in situ and invasive carcinoma of breast were 0.655，0.818，0.882 and 0.933，respectively. The result of p-ERK2 expression evaluated by Western blot technique was similar as the result which was evaluated by immunohistochemistry technique. There was statistical significance between p-ERK2-positive and ERK2-negative patients in different ages (χ2=5.677，P=0.017). There was not significant difference between ERK2 protein expression with the pathologic type，clinical stages and the survival rate. Conclusion p-ERK2 expression in breast cancer is significantly higher than benign lesions of breast. The factor has an important value on differentiation between the benign and malignant lesions of breast.

Key words：breast cancer；extracellular signal-regulated protein kinase；Western blot；immunohistochemistry

细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族的一员，它的信号传递涉及调节细胞生长、发育及分化的信号网络核心，在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。有研究表明ERKs一旦被激活，可以磷酸化一系列的胞浆蛋白，激活转录因子，启动细胞增殖［1］。与其他大多数肿瘤一样，乳腺癌的发生发展也是多因素、多途径、多步骤、多阶段作用的结果，其发病机制与细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡异常等有密切关系［2］。本文就ERK2在乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤及乳腺癌中的磷酸化表达进行观察，探讨其在乳腺癌发生、发展过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料：资料取自宁夏医学院附属医院2004年8月～2005年4月实施手术的乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌患者。患者全部为女性，术前未经放、化疗。21例乳腺腺病年龄最小24岁，最大74岁，中位年龄47岁；病灶位于乳腺左侧者10例，右侧者11例；肿瘤最大直径为7cm，最小为0.5cm，平均为3.37cm。21例乳腺纤维腺瘤年龄最小25岁，最大53岁，中位年龄38岁；肿瘤位于左侧乳腺12例，右侧9例；肿瘤最大直径5 cm，最小1.5 cm，平均值2.59 cm。96例乳腺癌年龄最小28岁，最大80岁，中位年龄48岁；左侧乳腺癌47例，右侧乳腺癌49例；癌灶最大直径10 cm，最小0.3 cm，平均3.37 cm；其中导管内癌12例，浸润性导管癌73例，浸润性小叶癌4例，黏液癌6例，典型髓样癌1例；49例无淋巴结转移，47例有淋巴结转移。

1.1.2 试剂：多克隆兔抗人p-ERK2抗体(NeoMarker Fremont公司生产)，硝酸纤维膜(Amersham Biosciences公司生产)，S-P免疫组织化学染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化技术：标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚5μm，行HE染色，光镜观察。选择包埋有病灶组织的石蜡块，5μm切片。使用SP二步法免疫组化检测试剂盒，按产品使用说明书进行操作，以迈新生物技术公司赠送的教学切片为阳性对照小，PBS代替一抗作为阴性对照，3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色。

p-ERK2蛋白表达于细胞浆，染色结果分为4个级别(高倍镜下20个视野)：阴性(-)，无阳性细胞或阳性细胞数＜5%；弱阳性(+)，阳性细胞数5%～25%；中度阳性(++)，阳性细胞数26%～50%；强阳性(+++)，阳性细胞数＞50%。

1.2.2 Western bloting分析：收集乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺原位癌、乳腺浸润性癌新鲜病灶组织各12例，加入组织裂解液冰上裂解组织，提取总蛋白。每份标本取总蛋白50μg经12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后将电泳产物转移至硝酸纤维膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗及二抗，5-氯-1-萘酚显色。应用Bio-Rad Co.生物医学图象分析系统对硝酸纤维膜上的目的条带进行扫描和密度分析。

1.3 统计学方法

利用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，行卡方检验和Kaplan-Meier生存分析。以P＜0.05作为差异有统计学意义。

2 p-ERK2蛋白表达结果

2.1 免疫组化检测结果

2.1.1 三种疾病p-ERK2免疫组化检测结果：p-ERK2表达在乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌之间差异具有统计学意义(P=0.000)。乳腺癌中p-ERK2表达阳性率明显高于乳腺腺病和乳腺纤维腺瘤(表1)。癌组织中p-ERK2表达与乳腺癌病变位置、癌灶大小差异无统计学意义(P＞0.05)。
表1 三种疾病p-ERK2免疫组化检测结果（略）

2.1.2 乳腺癌病理组织学类型与p-ERK2表达的关系：乳腺癌各种病理组织学类型p-ERK2表达阳性率均较高，主要以中等强度为主，阳性细胞多呈片状分布，75%(9/12)导管内癌、89.04%(65/73)浸润性导管癌、75%(3/4)浸润性小叶癌、83.33%(5/6)黏液癌、100%(1/1)典型髓样癌ERK2蛋白表达阳性(图1，见封2)，ERK2蛋白表达在各种类型之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.1.3 乳腺癌中p-ERK2表达与年龄的关系：按年龄分组可见，乳腺癌p-ERK2表达在不同年龄组差异有统计学意义，随着年龄的增加，p-ERK2表达阳性率降低(表2)。表2 不同年龄组乳腺癌p-ERK2表达结果（略）

2.1.4 乳腺癌中p-ERK2表达与淋巴结转移、临床分期的关系：从表3可见乳腺癌p-ERK2表达在不同淋巴结转移、临床分期差异无统计学意义(P＞0.05)。表3 乳腺癌中p-ERK2表达与淋巴结转移、临床分期的关系（略）

2.1.5 p-ERK2表达与乳腺癌生存率的关系：96例乳腺癌患者，有术后5年随访资料的47例，生存率为74.47％(35/47)，平均生存期为48.88个月。应用Kaplan-Meier分析乳腺癌ERK2蛋白表达与生存率的关系，ERK2蛋白表达阴性、阳性时的生存率分别为83.33%(5/6)、73.17%(30/41)，经统计学处理，时序检验的统计量为0.34(P=0.557)，乳腺癌ERK2蛋白表达与生存率无显著相关性(P＞0.05)。

2.2 Western blot检测结果

Western blot检测分析可见，乳腺癌组织p-ERK2表达明显增加。乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺原位癌、乳腺浸润性癌中p-ERK2表达的平均OD值分别为0.655、0.818、0.882、0.933，比值分别为1∶1.25∶1.35∶1.42(图2)，p-ERK2蛋白表达量与免疫组化检测结果一致。