【摘要】 【目的】 探讨美蓝法示踪和定位行乳腺癌前哨淋巴结活检（SLNB）的可行性及其临床意义，并探索常规病理检查（HE染色）、免疫组化染色（IHC染色）及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对判断前哨淋巴结（SLN）微转移灶的价值。【方法】 66例乳腺癌患者，用美蓝示踪行SLNB，对SLN及腋窝淋巴结（ALN）进行HE染色；随机选取40例SLN进一步行细胞角蛋白19（CK19）的IHC染色及RT-PCR检测；比较3种方法对SLN微转移灶检出的敏感性、准确率及假阴性率的差异。【结果】 66例中，美蓝示踪成功检出63例，检出率达95.5%。IHC与RT-PCR比较无差异，而与HE比较差异有显著性。【结论】 美蓝法SLNB也有很高的检出率，由于常规病理检查对微转移的诊断率低，结合IHC及RT-PCR检测能则有效判断乳腺癌腋淋巴结转移状态，提高SLN中微转移的检出率，降低假阴性率。

【关键词】 前哨淋巴结活检； 免疫组织化学； RT-PCR； CK19； 乳腺癌

Clinical Value of Sentinel Lymph Node Biopsy and Detection of Micrometastasis in

Sentinel Lymph Node in Breast Cancer

ZHUANG Ya-qiang, MO Jun-yang, REN Zhan-ping, LIANG Zhi-dong

( Department of Breast Surgery, The Fifth Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Liuzhou 545001, China )

Abstract:【Objective】 To investigate the possibility that methylene blue being used on sentinel lymph node biopsy (SLNB) in breast cancer and the value of hematoxylin and eosin staining (HE staining), immunohistochemistry (IHC) and RT-PCR in judging micrometastasis in sentinel lymph node (SLN).【Methods】 Sixty-six patients with breast cancer were injected methylene blue to detect the axillary SLN. The SLN and axillary lymph node were examined with HE staining. Random 40 cases were evaluated with IHC examination of cytokine 19 (CK 19) and RT-PCR. The accuracy, sensitivity, and false-negative ratio of HE staining, IHC examination and RT-PCR were compared to see if they had any discrepancy. 【Result】 SLN were successfully identified in 63 (95.5%) of 66 patients. IHC had no discrepancy compared with RT-PCR in the accuracy, sensitivity, and false-negative ratio, but it had obvious discrepancy with HE staining.【Conclusion】 Methylene blue can be used on the SLNB in breast cancer successfully. Since the sensitivity of HE staining was low, combined examination of IHC and RT-PCR would evaluate the micrometastasis more effectively, raise the efficiency of estimate of metastasis in SLN, and reduce the false-negative ratio.

Key words: sentinel lymph node biopsy; immunohistochemistry; RT-PCR; cytokine 19; breast cancer

[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（5）:553-556] 目前的研究证实，对腋窝淋巴结转移阴性的乳腺癌患者行腋窝淋巴结清扫（ALND）， 并不能提高其总体生存率和延长无病生存期[1]，其术后的并发症也一直是临床外科治疗的一大难题。近年来，通过前哨淋巴结活检（sentinel lymph node biopsy, SLNB）替代ALND来评价早期乳腺癌的腋窝淋巴结状况，从而使部分早期患者免行ALND，避免了其并发症。但常规病理在检测微转移灶方面相当困难，甚至可能漏诊，从而导致错误治疗决策。这一直是制约SLNB临床应用的重要原因。本研究在HE染色基础上，对其中40例联合应用免疫组织化学染色（immunohistochemistry, IHC）及逆转录聚合酶链反应(retro-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测SLN中CK19的表达，评价其对预测腋窝淋巴结转移准确性及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标 本

选取2005年6月至2006年10月在本科室住院的乳腺癌患者66例，行SLN活检。 66例患者平均年龄27～65（S=40.8）岁。其中Ⅰ期40例，Ⅱ期26例。病理类型：浸润性导管癌 30例，浸润性小叶癌13例，单纯癌 15例，其它类型 8例。术式：保乳术6例，改良根治术60例，术前均未行化疗。并对其中40例的SLN同时进行3种方法检测。

1.2 方 法

1.2.1 SLN的定位和取材 66例患者经穿刺或术中切除乳腺肿块快速活检确诊后，术中将1%美蓝分4点注射于乳晕下或肿瘤周围的皮下组织,按摩注射部位5～10 min，向乳腺尾部用电刀解剖寻找蓝染的淋巴管，沿蓝染淋巴管解剖鉴别蓝染的淋巴结即为SLN，共识别成功63例。切除SLN后，与随后清扫的腋窝ALN一起送常规病理检查。随机选取40例SLN，每个SLN均从中间剖开，一半用于常规HE及IHC染色，另一半置–80℃冻存，用于RT-PCR检测。整个过程严格避免上皮细胞的交叉污染（导致假阳性）。

1.2.2 病理学和免疫组织化学检查 对所有SLN及ALN均行常规HE染色检查。其中40例SLN进一步行免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用SP法。抗人细胞角蛋白单克隆抗体CK19染色试剂盒，DAB显色试剂盒等均购自福州迈新生物技术公司，染色步骤按试剂盒说明书进行，每批染色均设立阳性对照和阴性对照。光镜下见细胞膜及细胞质呈棕黄色颗粒判定为阳性染色。参照文献[2]，在显微镜下测量淋巴结内癌细胞巢直径 >2 mm者判定为“转移”，直径0.2～2 mm者为“微转移”，直径< 0.2 mm者为“孤立肿瘤细胞群”。

1.2.3 应用RT-PCR检测SLN中CK19 mRNA的表达 SLN中 RNA提取、cDNA合成、PCR试剂均由中山大学达安基因股份有限公司提供，实验方法参考试剂说明书。CK19的上游引物为5′-CTGAGTGACATGCGAAGCCAATA-3′，下游引物为5′-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3′。 cDNA模板对照：β2微球蛋白的cDNA ；阳性对照：乳腺癌细胞系MCF-7 的cDNA；阴性对照：胃肠道的良性病变淋巴结的cDNA ；假基因扩增对照：乳腺癌细胞系MCF-7 的基因组DNA（假基因是与已知的正常基因在碱基顺序上高度类似，有明显的相似性，但却失掉了作为基因机能的DNA区域。有文献报道用RT-PCR方法检测CK19基因表达时存在假基因干扰[3]，故本研究采用乳腺癌细胞系MCF-7 的基因组DNA进行扩增作为对照，以消除假基因的干扰) 。RT-PCR反应的条件为93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，共40个循环。

1.2.4 SLNB的评价标准 参照美国Louisville大学对SLNB技术的评价标准计算 SLN检出成功率=(SLN检出例数÷实验病人的总数)×100%；准确性=(SLN真阴性与真阳性例数之和÷SLN活检成功的总例数)×100%；灵敏度=(SLN阳性例数÷腋窝淋巴结转移例数)×100%；假阴性率=(SLN假阴性例数÷腋窝淋巴结转移的例数)×100%；特异性=[SLN真阴性例数÷(SLN阴性例数+SLN假阳性例数)]×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS10.0软件包对数据进行χ2检验。

2 结 果

2.1 SLN检出情况

通过美兰示踪 66名患者中，有63例检测到并切除SLN，SLNB成功率为95.5%(63/66例)；共切除SLN112枚，每例1～6枚（平均1.6枚），其中1枚者31例，2枚者19例，3枚者9例，>3枚者4例；NSLN共切除726枚，每例8～24枚，平均12枚。未探测到SLN的3例肿瘤分别位于乳腺内上象限。

2.2 病理学观察

SLN的HE结果与IHC、RT-PCR 检测结果比较；在40例中HE检测SLN转移阳性9例，阴性31例，假阴性2例（即SLN检测转移阴性，而ALN检测转移阳性）；ALN转移阳性11例，阴性29例。IHC法除证实其中9例外，对 HE染色阴性31例SLN行间距为100 ?滋m的6~8个层切片HE及IHC染色又发现10例微转移灶； RT-PCR法除证实其中9例外，又发现11例微转移灶；两例SLN HE检测假阴性者，经IHC、RT-PCR CK19检测均为阳性，故可判定为假阴性。3种检测SLN转移阳性率中, HE分别与IHC和RT-PCR比较差异有显著性,而IHC与RT-PCR两组间比较差异无显著性（表1）。3种检测对腋窝淋巴结转移预测的敏感度、准确率、假阴性率比较，经统计学处理，HE分别与IHC和RT-PCR比较差异有显著性；而IHC与RT-PCR比较差异无显著性（表2）。

3 讨 论

对乳腺癌来说，前哨淋巴结（SLN）是乳腺癌细胞转移的第一站淋巴结，其是否存在转移，可预测区域淋巴结的状况。前哨淋巴结活检术（SLNB）是由Cabanas [4]于1977 年首次报道，其后被Alex等[5]用γ探头示踪法以及Giuliano等[6]用染料示踪法用于乳腺癌。随后，乳腺癌SLNB的研究在国际上广泛开展，取得了很大的进展。近年来国内外的研究显示,乳腺癌SLNB能够准确评估区域淋巴结状态[7]，在一定程度上可替代传统的腋窝淋巴结清扫术（ALND），避免ALND 带来的后遗症。<