【摘要】 目的： 研究乳腺癌外周血乳腺上皮粘蛋白（SBEM）的表达及临床意义。方法： 用RTPCR法检测58例乳腺癌患者外周血SBEM mRNA的表达，并用健康志愿者及乳腺良性肿瘤患者各10例作为对照。结果： 78例标本全部确认转录为cDNA，SBEM在乳腺癌患者外周血的阳性表达率为25.9%，乳腺良性肿瘤和正常对照均无阳性表达，SBEM阳性表达与患者的腋淋巴结状况，TNM临床分期均有明显相关（P<0.05），而与患者的原发肿瘤大小及激素受体状况均无明显相关。结论： SBEM特异性表达于乳腺癌外周血，可作为标志物检测乳腺癌外周血微转移，并有可能成为诊断乳腺癌和判断预后的一个独立指标。

【关键词】 乳腺癌； SBEM mRNA； RTPCR； 微转移

Clinical significance of SBEM mRNA assay in peripheral bloodfrom patients with breast cancer

WU Min, ZHANG Jianxin, PANG Liqun, GU Yinjie

(Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001, China)

［Abstract］ Objective: To explore the expression of small breast epithelial mucin (SBEM) in peripheral blood(PB) from patients with breast cancer and their clinical signaficance. Methods： The expression of SBEM mRNA in PB was detected from 58 patients with breast cancer, 10 breast benign lesions and 10 healthy volunteers using RTPCR. Results： All of 78 samples had cDNA amplification. The positive expression rate of SBEM was 25.9%, no positive SBEM was in PB of patients with breast benign lesions and healthy volunteers. SBEM expression was correlated with axillary lymph nodes status and TNM stage, showing statistic difference(P<0.05). There were no significant differences between micrometastasis positive groups and any of other clinical parameters. Conclusion： SBEM was sensitive and specific for breast cancer, the positive expression of SBEM in PB might predict micrometastasis and be of value in the diagnosis and judgement of prognosis of breast cancer.

［Key words］ breast cancer; SBEM mRNA; RTPCR; micrometastasis

目前认为乳腺癌是一种全身性疾病，影响其预后的主要原因是远处转移。早期检测乳腺癌外周血中循环肿瘤细胞有助于亚临床转移的早期发现、指导临床治疗和判断预后。本实验利用RTPCR法检测乳腺癌患者外周血乳腺上皮粘蛋白（small breast epithelial mucin，SBEM）的表达，探讨其在乳腺癌微转移中表达的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集江苏大学附属医院普外科2006年3月至2006年10月经病理证实的乳腺癌患者外周血标本58例，年龄23~72岁，平均49.6岁；临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期16例，Ⅳ期5例。乳腺良性肿瘤患者及健康志愿者血标本各10例，所有患者均手术前采血，术前未经化疗或放疗等任何治疗。

1.2 仪器及试剂RTPCR试剂盒为Promega公司产品，MCF7乳腺癌细胞株购自ACTT，Trizol试剂为Intrigen公司产品，淋巴细胞分离液为灏洋公司产品，DNA标准参照物为东盛公司产品。SBEM mRNA引物参照文献［1］设计，由Invitrogen公司合成。

1.3 总RNA的抽提抽取外周血5 ml，EDTA抗凝，严格无菌操作，避免污染。用淋巴细胞分离液处理后离心分离出单个核细胞，用Trizol试剂抽提细胞mRNA。提取的mRNA在-70 ℃冰箱内冻存备用。

1.4 RNA的鉴定取适量RNA溶液，紫外分光光度定量，按1D(260 nm)＝40 μg/ml的标准，D 260/280的比值为1.8~2.1，说明RNA提取物的纯度较高，完全可以满足RTPCR的需要。

1.5 RTPCR按照RTPCR试剂盒操作，扩增SBEM及GAPDH，阳性对照以MCF7乳腺癌细胞株总RNA为模板，阴性对照以无菌去离子水代替模板RNA。

1.6 PCR产物分析以DNA标准参照物为分子量标志，1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下自显影，出现特异性条带者为阳性（图1,2）。

1.7 统计学处理采用STATA7.0软件，行χ2检验和Fisher确切概率法，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌、乳腺良性肿瘤及健康人外周血SBEM mRNA的表达在58例乳腺癌患者中，15例有SBEM mRNA表达，而在乳腺良性肿瘤及健康志愿者表达均为阴性，与良性肿瘤及健康对照比较均有统计学意义（表1）。

图1 内参照GAPDH的扩增结果电泳图略

图2 外周血SBEM的扩增结果电泳图略

表1 SBEM mRNA在乳腺癌、乳腺良性肿瘤及健康人外周血中的表达例（略）

2.2 SBEM mRNA表达与乳腺癌临床病理参数的关系 SBEM mRNA的阳性表达率与临床分期明显相关（表2），尤以Ⅳ期乳腺癌患者外周血SBEM阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者(P<0.05)，且SBEM的阳性表达与淋巴结状况明显相关(P<0.05)，而与患者的肿瘤大小、激素受体状况无明显相关(P>0.05)。

3 讨 论

癌细胞外周血微转移预示肿瘤可能复发，故以敏感的方法检测外周血中的循环肿瘤细胞与微转移灶的存在具有重要的治疗和预后意义。乳腺上皮粘蛋白(SBEM)是2002年5月Richard等［1］利用公共序列表达的同位素标记技术(EST)和基因表达分析数据库(SAGE)首次报道的一种新的用于检测乳腺癌微转移的标志物。该蛋白表达具有特异性，仅在乳腺和唾液腺中表达，与muc1相比具有高度特异性，可用于乳腺癌微转移的检测，可作为临床早期诊断乳腺癌生物学标志物，该作者检测54例乳腺癌组织SBEM有50例阳性(90%)，同时该指标与人乳腺珠蛋白(hMAM)相关，它们常常高表达于阳性淋巴结。2005年杨华伟等［2］利用巢式RTPCR技术检测67例乳腺癌，16例乳腺良性肿瘤及20例健康志愿者外周静脉血的SBEM mRNA，结果67例乳腺癌SBEM mRNA表达率为50.7%(34/67)，而良性肿瘤及健康志愿者表达均为阴性，提示SBEM特异表达于乳腺癌患者的外周血，有可能作为检测乳腺癌血行微小转移的指标。

表2 SBEM mRNA表达与乳腺癌临床病理参数的关系例（略）

本实验利用RTPCR方法进行乳腺癌外周血SBEM的检测，结果显示SBEM仅表达于乳腺癌外周血，在良性肿瘤患者及健康志愿者中表达为阴性，且随着临床病期的进展，SBEM表达率增高，尤其SBEM在乳腺癌临床Ⅳ期表达率高达80%，以上均提示SBEM可能成为检测乳腺癌微小转移的特异性指标，乳腺癌患者外周血SBEM阳性提示存在肿瘤细胞。虽然外周血肿瘤细胞不一定都能转移或复发，但当机体免疫功能低下时微量癌细胞的播散就有可能增加转移灶产生的危险性，故早期发现对乳腺癌患者的诊断及综合治疗起着非常积极的作用。同样，在乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期可以检测到SBEM表达，提示部分早期乳腺癌患者也可能有血循环的微转移。这也说明了乳腺癌是一种早期可出现转移的全身性疾病，这也从某个角度印证了有关研究提出的腋淋巴结阴性患者仍有近30%于术后5年内出现复发、转移而导致死亡［3］的观点。因此，SBEM作为微转移的检测指标对临床上没有发现肿块的早期乳腺癌患者将可以早期诊断和治疗，提高生存率，减少死亡率；对于乳腺癌术后的患者可以长期动态监测，适时了解病情及调整治疗方案。本实验中，SBEM表达与淋巴结是否转移显著相关，说明外周血SBEM阳性表达能够反映病期，一旦检测到外周血SBEM阳性，应该考虑积极给予全身综合治疗。SBEM阳性与患者肿块大小、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)状态无关，但是ER、PR 阴性者较阳性者SBEM mRNA阳性表达率增高，提示发生血行转移的危险可能更大，激素受体阴性细胞可能具有更强的侵袭性，预后更差。综上所述，SBEM作为乳腺癌外周血微转移的检测指标，具有高度特异性，对于乳腺癌的诊断、治疗及长期监测起着非常积极的作用。本实验样本量尚少，若能增加样本量并对其长期动态监测、随访， SBEM与临床病理参数（肿块大小、ER,PR状态等）及预后的关系将得到进一步的考证，有可能成为乳腺癌独立的预后指标。

【参考文献】
［1］ Miksicek RJ, Myaly AT, Watson PH, et al. Identification of a noval breast and salivary gland specific, Mucin like gene stong expressed in normal and tumor human mammary epithelium［J］. Cancer Res, 2002, 62(10): 2736-2740.

［2］ 杨华伟, 刘剑仑, 曹 骥, 等. 乳腺癌患者外周血SBEMmRNA和CD44V6的检测及其临床意义［J］. 中国肿瘤临床, 2005, 32(7): 382-385.

［3］ Carcoforo P, Bergossi L, Basaglia E, et al. Prognostic and therapeutic impact of sentinel node micrometastasis in patients with invasive breast cancer［J］. Tumori, 2002, 88(3): S4-S5.