【摘要】 目的 探讨乳腺癌患者外周血中 HMGA2 mRNA的表达,建立检测外周血早期诊断乳腺癌微转移的方法。方法采取109例乳腺癌和62例乳腺良性疾病患者的外周血,运用RT-PCR技术进行 mRNA的检测。结果 109例乳腺癌患者HMGA2 mRNA有41例表达,总阳性率为37.60％。62例乳腺良性疾病者HMGA2 mRNA无一例表达。两组有统计学意义( X2=7.35,P < 0.001)。结论 HMGA2可以用于临床检测乳腺癌患者外周血中微转移,有可能成为判断预后和指导治疗的指标。

【关键词】 乳腺癌外周血微转移HMGA2 mRNA

Clinical Significance of HMGA2 mRNA Detection in Peripheral Blood of Breast Cancer Patients by RT-PCR

LIU Lanji HAN Meng LIU Ruiju

Department of General Surgery, The Third Clinical Hospital of JiLin University ,Chang Chun , 130021

【Abstract】 Objective To explore the expression of HMGA2 mRNA in peripheral blood of breast cancer patients ,and establish the method of early diagnosis of breast cancer micrometastasis through dectecting peripheral blood. Methods The expression of HMGA2 mRNA was evaluated by RT-PCR in the peripheral blood of 41 breast benign lesions and 72 breast cancer patients.Results 27 were positive in all 72 breast cancer patients,the positive detection rate was 37.5%,41 breast benign lesions patients were all negative detection for the expression of HMGA2 mRNA. These two groups have statistical significance.Conclusion HMGA2 mRNAexpression in the breast cancer patients peripheral blood can be used to detect the micrometastasis,and it may be the marker of prognosis and treatment.

【Key words】breast cancerperipheral bloodmicrometastasisHMGA2 mRNA

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤,其治疗失败主要为血行转移。Piel等采用大样本乳腺癌多变量分析结果显示微转移是一个独立的预后指标,其价值优于肿瘤的分级和分期,因此,能够发现处于亚临床阶段的微转移癌对于具有重要的临床价值,本课题利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以HMGA2 mRNA作为分子标记物,检测乳腺癌患者外周血的微转移情况,建立一种新的诊断乳腺癌微转移的敏感和特异的方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2004年10月至2005年10月我院治疗的乳腺癌患者109例，均为女性，年龄最大69岁，最小28岁，平均43.9岁。抽血前均未接受化学治疗和放射治疗。所有患者均经手术治疗证实，手术后均经病理诊断，其中浸润性导管癌79例，乳头状癌19例，鳞状细胞癌7例，髓样癌2例，黏液癌2例。根据UICC分期，其中Ⅰ期53例，Ⅱ期44例，Ⅲ期12例。腋窝淋巴结阳性57例，阴性52例。同时选取同期乳腺良性疾病62例为对照，其中乳腺纤维瘤38例，乳腺囊性增生14例，浆细胞性乳腺炎10例，术前经胸片，B超，CT及骨扫描等检查未发现明显的转移灶。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂异硫氰酸胍，β巯基乙醇，DNA Marker,琼脂糖为Ferment公司产品。其他试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。引物及内参照：HMGA2 mRNA引物及内参照按文献[2]由上海生工生物服务有限公司合成：A:5’-CTTCAAAAGATCCAACTGCTGCTGAGG-3’,B: 5’-CCGGTGAGCCCTCTCCTAAGAGACCC-3’。内参照GAPDH的序列5’-GTCAGTGGTGGACCAGACCT-3’,5’AGGGGAGATTCAGTGTGG-3’，用来排除RNA的降解。

1.2.2主要仪器 PE－型基因扩增仪（美国PE公司）;紫外分光光度仪（UV751-GD）型，上海第二分析仪器厂）；UVP-GDS7600型凝胶成像分析系统（美国），UP-890型打印机（日本SONY公司）。

1.3方法取用0.5mol/L EDTA 抗凝静脉血4ml,用淋巴细胞分层液分离有核细胞，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿-异戊醇方法提取总RNA.以Oligo(dT )18为非特异性引物，用重组鼠白血病病毒逆转录酶合成cDNA。在薄壁的离心管中加入2×PCR混合物25μl(内含2×PCR缓冲液，0.2 mmol/LdNTP,0.1U/μl TagDNA聚合酶，3mmol/L MgCl2),引物A和B各1μl（浓度为1μmol/L）,cDNA 1μl及无菌的去离子水22 μl反应终体积为50 μl。PCR扩增：94 0C预变性300 S;94 0C 30 S,65 0C 30 S,72 0C 60 S,共35个循环,720C 7 min平衡后结束反应 ,取扩增产物15 μl，20 g/L的琼脂糖（含溴化乙锭0.5μg/ml）电泳。HMGA2阳性扩增后为220 bP的条带，内参照GAPDH的扩增后为299 bp的条带，内参照GAPDH：每份样本均进行以内参照序列为引物的PCR扩增，反应条件同上。

1.4 统计学方法 数据行四格表X2检验，P< 005表示有统计学意义。

2 结果

乳腺癌与乳腺良性疾病患者外周血中HMGA2 mRNA的表达见附表。由表可见，109例乳腺癌患者的外周血中有41例HMGA2 mRNA表达，阳性率为37.60％，62例乳腺良性疾病患者外周血中无一例HMGA2 mRNA表达，两组用X2检验，具有统计学意义（P<0.001）.本实验HMGA2 mRNA的特异性[特异性＝良性组真阴性例数/（良性组真阴性例数＋良性组假阳性例数）]为100％（62/62），敏感性[敏感性＝恶性组真阳性例数/（恶性组真阳性例数＋恶性组假阴性例数）]为37.60％。Ⅰ期,Ⅱ期，Ⅲ期乳腺癌患者外周血HMGA2 mRNA阳性率分别为20.69％，42.85％，75.00％，用X2检验Ⅰ期,Ⅱ期，Ⅲ期无统计学意义（P> 0.05）.Ⅰ期和Ⅲ期具有统计学意义（P< 0.05）.腋窝淋巴结阳性和阴性外周血HMGA2 mRNA阳性率分别为5263％，20.58％，两组用X2检验，具有统计学意义（ P< 0.05）.

附表乳腺癌与乳腺良性疾病患者外周血中HMGA2 mRNA的表达（略）

3 讨论

乳腺癌其治疗失败主要原因是因为转移，因此，认识和判断有无转移对临床诊断治疗和判断预后有重要意义。由于微转移细胞数很少，常规的病理学和免疫学技术因其准确度和灵敏度不高，难以取得令人满意的结果。RT-PCR是一种较为敏感的检测技术，能快速扩增细胞内特异性的mRNA的表达，并可以在107个单核细胞检出一个克隆和10个乳腺癌细胞[3],其灵敏度可达（2～5）×107，并预示肿瘤的微小转移[4],许多学者利用此技术已经在多种肿瘤患者的血循环找到微转移的肿瘤细胞。由于目前在实体瘤中尚无特异明确的肿瘤标记物，因此，主要采用组织特异 mRNA转录物为标记物，最近有学者发现HMGA2的表达的高低与乳腺癌的恶性程度有关，在31例Ⅲ级乳腺癌病例中，有25例存在HMGA2的高表达，而24例Ⅰ～Ⅱ级者仅有4例表达，说明HMGA2的表达水平和乳腺癌的组织学分级密切相关[5],本组实验在109例乳腺癌患者的外周血中有41例HMGA2 mRNA表达，而乳腺良性疾病患者中没有HMGA2 mRNA表达（P < 0.01 ）.说明HMGA2 mRNA仅在乳腺癌中表达，在乳腺良性疾病中不表达，其特异性为100％，109例乳腺癌患者外周血中HMGA2 mRNA检出的阳性率为37.60％，与O.Sezer等[6]报道的结果相似。乳腺癌Ⅰ期,Ⅱ期，Ⅲ期的外周血中HMGA2 mRNA阳性表达率分别为22.64％，4545％，75.00％，结果表明乳腺癌分期与微转移有关，即分期越高转移几率越大,C. Longelotz等[7]报告外周血中HMGA2和总生存率有关，是判断预后的独立指标。乳腺癌患者腋窝淋巴结阴性和阳性的外周血中HMGA2 mRNA阳性率分别为21.15％，52.63％。具有统计学意义（P< 0.05）,表明外周血中HMGA2阳性率与乳腺癌患者腋窝淋巴结转移明显相关。本组所有患者均随访，截止至2005年10月，有6例微转移者发现有远处转移（肺转移4例，肝转移1例，骨转移1例），而无微转移者仅有1例出现骨转移，经X2检验，无统计学意义（P>0.05）,可能与病例数较少和随访时间短有关，但至少可以提示有微转移其远处转移几率增大，虽然目前对微转移的临床意义尚有争议，但至少可揭示其具有转移倾向。随着乳腺癌是一种全身性疾病理论的提出，乳腺癌的治疗观念有了极大的改变。文献报道腋窝淋巴结阴性的乳腺癌患者中有20％～30％存在远处转移[8],因此检测肿瘤细胞的早期血行转移具有重要的临床意义。近年研究表明循环肿瘤细胞的存在与乳腺癌患者的复发及预后相关[9],虽然目前尚不清楚循环肿瘤细胞阳性的患者能否从强化治疗中受益[10],但考虑这部分患者可能具有更高的血运转移风险，临床中应选择适当的辅助治疗，并加以监测，对未检出有微转移的患者可以免除不必要的强化治疗。

【参考文献】
1 Parker.SL,Tong T,Bolden S.et al .Cancer statistics.CA Cancer J Clin,1996;46(1):5.

2 Stasiak PC,Purkis PE,Leigh IM,et al.Keratin 19：predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins.J Invest Dematol,1989;92(5):707.

3 Fukudaoy H J,Fukuda Y,O ikawa S,et al.Metastatic potential in nude mice of Chinese hamster ovay cells expression human carcinoma bryonic antigen. Biochen Biophys Res Comun,1994;200(3):1748

4 KoderaY,Yamamura Y,Torii A,et al.Postoperative staging of gastric carcinoma.A comparioson between the UICC stage classification and the 12 th edition of the Japanese General Rules for Gastric Cancer Study.Scand J Gastroenterol,1996;31(5):476.

5 Rogalla P,Drechsler K,Kazmierczak B,et al.Mol Carcinoma,1997,19(3):153.

6 O.Sezer