【关键词】 乳腺癌

【摘要】 目的 探讨乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平变化的临床意义。 方法 采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测40例健康人和41例乳腺癌患者外周血血小板活化标志物水平，并作对比分析。 结果 乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平与正常对照组相比CD62P，CD63水平明显增加，两者之间差异有显著意义，P<0.01。乳腺癌患者外周血血小板活化标志物水平分别受年龄、临床分期、手术与否及肿瘤有否转移等因素影响。 结论 外周血血小板活化标志物可能成为监测乳腺癌患者病情进展的动态指标。

恶性肿瘤的转移和复发是患者预后不良的主要原因，它是一个多环节的复杂过程。肿瘤细胞脱离原发灶进入血循环是一个关键步骤，血小板对肿瘤细胞血行转移的所有步骤都有促进作用，并直接参与肿瘤细胞的转移过程 ［1］ 。CD62P、CD63是最近发现的黏附分子家族中的一员，定位于血小板的a颗粒和内皮细胞棒管状（Weible-Palade）小体内，能介导血小板及血管内皮细胞和肿瘤细胞的黏附，促进肿瘤转移 ［2］ 。鉴于活化血小板对肿瘤细胞转移过程中的重要作用，检测血小板活化水平对监测乳腺癌患者病情进展及患者预后有十分重要的临床意义。

我们采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测乳腺癌患者和健康体检者外周血血小板活化标志物水平，同时分析不同临床分期，转移与否和手术前后乳腺癌患者外周血血小板活化标志物水平，探讨乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平变化的临床意义。

1 材料与方法

1.1 检测对象 2003年1月～2004年9月来我院就诊的乳腺癌患者41例，年龄32～77岁，中位年龄54岁。所有病例均获得病理诊断。临床分期采用国际TNM统一分期法。另选40例同期来我院体检的健康者为对照。

1.2 主要试剂、仪器 （1）试剂:CD61-FITC、CD62P-PE、CD63-PE及同型对照IgG1-PE（购自IMMUNOTECH公司）。（2）仪器:Beckman-Coulter流式细胞仪，型号EPICS-XL。

1.3 标本收集 抽取空腹外周静脉血1ml，枸椽酸钠抗凝。抽血时要求取末端血，防止振荡并在30min内标记。

1.4 检测方法 采用流式细胞术检测外周血血小板活化标志物CD62P和CD63。检测步骤包括:在三支试管中各加入CD61-FITC10μl后，再分别在不同试管中加入IgG1-PE10μl，CD62P-PE10μl和CD63-PE10μl。用200μl PBS稀释后，各加入5μl全血，室温避光静置15min后上机检测;使用阴性对照管（CD61-FITC+IgG1-PE）调整电压后，检测标记CD62P-PE和CD63-PE;用CD61设门，分析CD61门中表达CD62P和CD63的阳性率，再分别对单纯血小板及黏附在细胞上的血小板进行活化分析，分别得出单纯血小板、黏附在细胞上的血小板及总的血小板的活化状况见图1，2。即:CD62P阳性率=CD61门中标记上的CD62P血小板/CD61门中全部血小板×100%;CD63阳性率=CD61门中标记上的CD63血小板/CD61门中全部血小板×100%。

1.5 统计学处理 使用SPSS10.0统计软件包进行分析。计量资料用ˉx±s表示。计量资料的均数比较用t检验及方差分析，多组间两两比较采用LSD法，P<0.05差异有显著意义。

2 结果

2.1 各组外周血血小板活化标志物检测水平 乳腺癌患者及健康志愿者的外周血血小板各活化标志物检测结果见表1，乳腺癌组的各个活化标志物水平均明显高于健康对照组，统计学上差异均有非常显著意义，P<0.01。

表1略

2.2 乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平的影响因素 乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平的影响因素，包括:年龄、临床分期、手术与否和肿瘤的转移。Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血血小板活化标志物的检测水平各个指标均显著高于Ⅰ、Ⅱ期，具有统计学意义，P=0.012、P=0.014、P=0.000、P=0.000、P=0.001、P=0.012;乳腺癌患者手术与否除单纯血小板的CD63活化水平（P=0.123）及总的CD63活化水平（P=0.075）外，均影响其他指标，未行手术的患者活化水平明显高于行手术的，并均有统计学意义，P<0.05;有转移的乳腺癌患者无论单纯血小板活化标志物检测水平及黏附在细胞上的血小板活化标志物检测水平还是外周血总活化标志物检测水平均显著高于没有发生转移的瘤患者，P值均为0.000;同时我们还观察到乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平各个指标受年龄的影响，60岁以上的患者各检测指标明显高于60岁以下的患者，P值均为0.000;结果见表2。

表2略

3 讨论

血小板表面含有丰富的膜糖蛋白，它们在维持血小板正常形态及参与血小板黏附、聚集、释放等功能中有重要意义。在循环血液中，正常人的血小板基本处于静息状态。而血管内皮的损伤、血小板与肿瘤细胞相互作用及作用时释放的生物活性物质是血小板激活和释放的主要原因。研究表明，几乎80%以上的恶性肿瘤患者均发生凝血异常，已发现恶性肿瘤患者血液循环中的组织因子（TF）、凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物以及血小板明显增高 ［3，4］ 恶性肿瘤患者血液循环中组织因子和凝血酶的异常增高不仅引起血小板的活化、聚集并与血循环中的肿瘤细胞、血管内皮细胞黏附，促进肿瘤细胞的血行转移，而且还可能介导血管生成 ［5，6］ 。CD62P和CD63的表达是血小板激活后α颗粒和溶酶体颗粒释放的标志 ［7］ 。在正常状况下，血小板膜表面不表达或低表达P-选择素，P-选择素只在巨核细胞、血小板α颗粒内和内皮细胞Weibei-Palade小体内表达。当血小板被激活，血小板α颗粒则将其介膜内的P-选择素释放至血小板膜表面，在血小板膜表面高表达P-选择素，被释放出的P-选择素与荧光单抗结合后，可被流式细胞仪检测到。

本组资料表明，乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平明显高于正常人，且乳腺癌患者外周血CD62P、CD63检测水平随临床分期的增高逐渐增高，特别是Ⅲ、Ⅳ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者高，表明血小板激活及激活后的释放反应在乳腺癌患者中或多或少存在，晚期患者尤为明显。血小板α颗粒包含的凝血酶敏感蛋白（TSP）、纤维粘连蛋白（Fn）、纤维蛋白原（Fg）和vWF可作为不同黏附分子的配基，促进肿瘤细胞-血小板-内皮细胞的相互作用。α颗粒释放的血小板第4因子、血小板血管通透因子对肿瘤细胞的着床及向血管外渗透起着重要作用。α颗粒包含的许多生长因子，如PDGF和TGF-β，促进肿瘤细胞在血管内的增生和侵袭。

本组资料还显示乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平还受手术与否和肿瘤转移等因素的影响。中、晚期乳腺癌患者外周血血小板活化标志物检测水平显著高于早期;乳腺癌患者经手术切除肿瘤后，外周血血小板活化标志物检测水平会明显下降;当肿瘤发生转移时，外周血血小板活化标志物检测水平明显升高。

综上所述，乳腺癌患者尤其是晚期患者血小板的激活相当广泛，激活的血小板导致粘附分子的表达和释放产物的增加，由此可增强肿瘤细胞与血管内皮细胞和基底膜（ECM）的粘附，而有利于肿瘤细胞的血行转移。因此，采用流式细胞术检测乳腺癌患者外周血血小板活化标志物的水平变化有可能成为监测乳腺癌患者病情进展的动态指标之一。

（本文图片略）

【参考文献】

1 张培彤，裴迎霞.肿瘤患者与正常人血小板表面黏附蛋白表达异同的临床观察及意义.中华肿瘤杂志，1998，20（3）:207-209.

2 Bombeli T，Schwartz BR，Harlan JM.Adhesion of activated platelets to endothelial cells:evidence for GPⅡb-Ⅲa-dependent bridging mechanism and novel roles for endothelial intercellular adhesion molecule1（ICAM-1），ανβ3integrin，and GPⅠb-Ⅱa.J Exp Med，1998，187（3）:329-339.

3 Shoji M，Hancock WW，Abe K，et al.Activation of coagulation and angiogenesis in cancer.Am J Pathol，1998，152（2）:399-411.

4 Verheul HMW，Hoekman K，Lupu F，et al.High VEGF concentration and activation of coagulation pathway，including platelets，in aspirated fluids of soft tissue sarcoma.Clin Cancer Res，2000，6:166-171.

5 Verheul HMW，Hoekman K，Luykx-de Bakker S，et al.Platelets:transporter of vascular endothelial growth factor.Clin Cancer Res，1997，3（12PT1）:2187-2190.

6 Pindo HM，Verheul HMW，D'Amato RJ，et al.Involvement of platelets in tumor angiogenesis?Lancet，1998，352（28）:1775-1777.

7 Kehrel B，Wierwille S，Clemetson KJ，et al.Gycoprotein VI is major Collagen receptor for platelet activation:it recognizes the platelet-acti-vating quaternary structure ofcollagen，whereas CD36，glycoprotein Ib/II a，and von Willebrand factor do not.Blood，1998，91:491.

作者单位:650118云南省肿瘤研究所

（编辑:守 中）