【摘要】 探讨WWOX基因在乳腺癌组织中的表达及其与雌激素受体(estrogen receptor, ER)、绝经状态等临床病理学特征的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测56例正常乳腺组织、12例乳腺导管原位癌和87例侵袭性乳腺癌组织WWOX蛋白的表达，结合临床病理学资料进行分析。结果：62.1%(54/87)的乳腺癌组织和28.6%（16/56）正常乳腺组织中出现WWOX蛋白表达降低或丢失，两组间差异有统计学意义（P＜0.01 ）。50%的乳腺导管原位癌组织中WWOX 蛋白表达降低。82.1% 的ER（-）组和 52.5% ER（+）组病例表现为WWOX蛋白表达降低或缺失，差异有统计学意义(P＜0.05)。51.8%的绝经后患者和22.4%的绝经前患者出现WWOX表达完全缺失，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。此外，晚期乳腺癌患者WWOX表达降低或缺失的比例增高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者中WWOX表达完全缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%，各期间的差异有统计学意义（P＜0.01）。结论:乳腺癌中存在着WWOX基因的表达缺失，其异常表达与ER状态、绝经状态和肿瘤临床分期关系密切，提示WWOX基因可能是通过激素受体信号途径在乳腺癌的发生和发展中发挥作用。

【关键词】 乳腺肿瘤 基因 WWOX 雌激素受体 绝经期

WANG Xiao1，2, CHAO Lan2，ZANG Yixiu1, CHEN Linsheng1, TIAN Bin1, LIU Huiping1， SUN Jingzhong2

（1. Department of Breast Cancer, Jinan Central Hospital, School of Medicine, Shandong University,

Jinan 250013, Shandong, China; 2. Department of Breast Cancer, Qilu Hospital of Shandong University,

Jinan 250012, Shandong, China）

［ABSTRACT］ Objective： To evaluate the relationship between WWOX expressions at the protein level and the clinicpathological characteristics of human breast cancer. Method： Expression of WWOX was determined by immunohistochemical staining in a total of 155 tissue microarrays including 56 normal breast tissues, 12 ductal carcinoma in situ cases and 87 primary invasive breast carcinoma specimens. Results： A decreased or lost of WWOX expression was observed more frequently in invasive tumors (62.1%) when compared with normal breast tissues (28.6%) (P＜0.01). 82.1% of ER（-）cases and 52.5% of ER（+）cases showed a decrease or lost of WWOX expression(P＜0.05). 22.4% of premenopausal cases were completely negative for WWOX expression versus 51.8% for postmenopausal breast carcinomas (P＜0.05). Furthermore, 23.1% of stage Ⅰ (6/26), 28.6% of stage Ⅱ (10/35), and 46.2% of stage Ⅲ (12/26) tumors showed a negative WWOX protein expression (P＜0.01). Conclusions： Loss of WWOX is a common event in breast cancer. Associations of WWOX expression with ER status, menopausal status and clinical stage of the disease strengthen the hypothesis that WWOX plays a role in carcinogenesis and development of breast cancer in a pathway or pathways associated with sex steroid metabolism.

［KEY WORDS］ Breast neoplasms； Genes； WWOX； Estrogen receptor； Menopausal status WWOX（WW domain containing oxidoreductase）基因是跨越了整个常见染色体脆性部位FRA16D的一个新的抑癌基因［1］，主要在激素调节组织中表达。WWOX蛋白被推测为参与类固醇调节的酶［2］，与多种肿瘤特别是激素依赖性恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的发生有关,目前在肿瘤细胞系和动物实验方面的研究较多，临床病例研究较少。本研究采用免疫组织化学SP法检测浸润性乳腺癌组织、乳腺导管原位癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）和乳腺正常组织中WWOX蛋白的表达，并与雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、HER2/neu蛋白、绝经状态及临床分期等临床病理学指标对比分析，旨在探讨WWOX基因表达与类固醇激素表达和乳腺癌浸润、转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2005年10月 2007年3月在山东大学济南市中心医院手术切除的乳腺癌标本87例、DCIS 12例、正常乳腺组织56例（距肿瘤5 7?cm的乳腺组织34例及同期手术切除的副乳腺组织22例,均经病理学检测证实）。乳腺癌组织学类型为：浸润性导管癌74例，浸润性小叶癌6例，粘液腺癌4例，髓样癌3例。所有病例均为女性，年龄27 75岁，中位年龄49岁。TNM分期:Ⅰ期21例，Ⅱ期40例，Ⅲ期26例。所有患者术前均未行化疗及内分泌治疗。

1.2 免疫组织化学染色 标本用10%缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚5?μm，脱蜡和水化后，经0.1%胃蛋白酶消化15?min,抗原修复30?min，然后按SP法操作，主要步骤如下：3%H2O2孵育10?min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10?min，滴加兔抗人WWOX多克隆抗体（abcam 公司，No: ab14691，工作浓度1∶100），室温孵育2?h，滴加生物素标记兔抗羊抗体，37?℃ 20?min；滴加SP复合物，37?℃ 20?min。各步骤用0.01?mmol/L,pH7.4 PBS缓冲液冲洗，DABH2O2液显色，苏木素复染、脱水、透明、封固。阴性对照用PBS替代WWOX一抗。 应用HER2/neu单克隆抗体（Dako 公司，No:K5204），ER/PR单克隆抗体（ADI公司，No:M0241/0448），SP法操作。用已知的阳性片作阳性对照，PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。

1.3 结果判断 ① WWOX染色表达于细胞浆，为棕黄色颗粒，根据染色的程度和范围判定分级，染色程度分为：无染色；中等染色；深度染色。染色范围分为：＜10%；11% 25%；26% 50%；51 75%；76% 100%。染色的程度和范围相乘为染色评分。染色评分为12 15（染色程度为3，染色范围为4或5）被认为是WWOX表达无缺失，染色评分2 12为表达降低，细胞浆内无棕黄色染色为表达完全缺失；② ER/PR染色表现为细胞核内棕黄色颗粒，以细胞的染色程度和阳性细胞数量作为判断，阳性细胞数 ＜10% 为（-），11% 25%为(+), 26% 75%为(+2 结 果

2.1 WWOX蛋白在正常乳腺组织和癌组织中的表达 56例正常乳腺组织中有53例呈现不同程度的WWOX染色，71.4%(40/56)表现为强染色（见图1A、B），23.2% (13/56)为染色降低，5.4%（3/56）例染色缺失。50%（6/12）的DCIS表现为强染色（见图1C），16.7%（2/12）表现为染色缺失。32.2%(28/87) 的乳腺癌组织WWOX染色缺失（见图1D），29.9%(26/87)的病例染色降低，与正常乳腺组织相比差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。WWOX染色主要位于细胞浆，本组病例中有3例乳腺癌患者的染色图片中出现细胞核和细胞浆同时染色（见图1E、F）。 图1 正常乳腺和乳腺癌组织WWOX染色

A：正常乳腺上皮组织细胞WWOX强染色（SP法×40）； B：乳腺导管腔上皮细胞WWOX染色（SP法×100），表现为细胞浆内棕黄色颗粒； C：乳腺导管原位癌WWOX强染色（SP法×40）；D： 乳腺癌组织WWOX染色缺失（SP法×100）； E：乳腺癌组织WWOX强染色（SP法×100）； F：示乳腺癌组织中WWOX染色同时位于细胞浆和细胞核内（箭头处）SP法×200）

*2.2 乳腺癌组织中WWOX表达与临床病理学指标的关系 乳腺癌组织WWOX表达降低或缺失与ER状况关系密切，82.1%的ER（-）标本和52.5%的ER（+）标本WWOX表达降低或完全缺失（P＜0.05）。乳腺癌组织中WWOX表达的降低或缺失与绝经状态有关，20.7%绝经前患者和57.2%的绝经后患者WWOX表达降低或缺失，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；晚期乳腺癌患者出现WWOX表达降低或缺失的比例增高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者中WWOX表达完全缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%，各期之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。乳腺癌组织WWOX表达与PR、HER2/neu及腋窝淋巴结转移等指标的关系差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

3 讨 论

DNA损伤是恶性肿瘤发生发展的重要机制，染色体脆性位点基因对DNA损伤高度敏感。WWOX基因是2000年由Bednarek等应用鸟枪基因测序技术结合对感兴趣区域对应的转录子进行分离并分析的方法鉴定出的一个新基因［1］，位于染色体脆性位点FRA16D，定位于染色体16q23.324.1区，是脆性位点杂合性缺失的常见部位［2］。WWOX基因表达缺失与多种肿瘤的发生有关，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌及食管癌等［37］。

本组病例中，大约2/3的乳腺癌组织和近1/3的正常乳腺组织表现为WWOX蛋白表达降低或缺失，结合文献报道，说明WWOX基因的表达异常可能在乳腺癌的发生中发挥了重要作用。此外，有50% 的DCIS出现WWOX蛋白表达降低，提示WWOX基因在正常乳腺组织、乳腺癌前病变及浸润性乳腺癌中的表达呈现下降的趋势。WWOX蛋白染色主要表现为细胞浆内棕黄色颗粒，但本组3例乳腺癌标本中出现细胞核染色，与Watanabe报道的少数乳腺组织细胞浆和细胞核内同时出现WWOX染色一致［8］。

WWOX基因在不同的乳腺癌细胞系中的表达差异很大，ER阳性表达的MCF7和T47D细胞系中 WWOX蛋白高表达，而ER阴性 的MDA435和MD