【摘要】 目的 探讨syk基因在人乳腺癌组织中及其乳腺癌细胞株中的表达及其生物学意义。方法 采用荧光定量PCR方法和免疫组织化学方法分别检测乳腺癌细胞株MCF7、MDAMB231、人乳腺癌癌组织和配对癌旁正常乳腺组织中syk mRNA与蛋白表达及其临床病理特征的关系。结果 乳腺癌细胞株MCF7中SYK蛋白表达为阳性；MDAMB231的SYK蛋白为阴性；乳腺癌组织、正常乳腺组织syk mRNA表达阳性率分别为633%（19/30）、933%(28/30)。乳腺癌癌组织syk mRNA的平均水平〔（617±0065）×104〕明显低于配对的癌旁乳腺组织〔（8037±0125）×104〕(P＜001)。SYK蛋白在乳腺癌、癌旁正常组织表达阳性率分别为60%（18/30）、90%(27/30)(P＜001)。SYK表达下调与乳腺癌淋巴结转移和临床TNM分期显著相关(P＜005)，而与肿瘤的大小、病例分级、ER和PR状况无关( P ＞005)。结论 SYK基因低表达或缺失与肿瘤的浸润、转移有关。

【关键词】 乳腺癌；细胞株；SYK；基因表达；荧光定量PCR；免疫组织化学法

目前，对于乳腺癌还没有较好的诊断方法。肿瘤标志物检测在乳腺癌的早期诊断、治疗方案选择、病情观察和转移监测、疗效评价以及群体随访观察和普查等方面有重要意义。近来发现在乳腺癌细胞生长和转移中重要的抑制因子syk是在乳腺组织细胞的信号传导中起关键作用的一种蛋白质，与肿瘤的生长和发展密切相关。国内已有定性、半定量方法检测人乳腺癌中syk表达情况及其作用机理与甲基化有关的报道〔1，2〕，然而，仍未有全定量检测方法精确的显示syk在乳腺癌中的表达。本研究应用RTPCR方法、免疫组织化学法测定其syk基因、蛋白表达的差异及其临床病理特征的关系，为乳腺癌的早期诊断、制定合理经济的治疗方案及其预后评价提供理论依据。

1 材料与方法

11 病例选择 随机选取2004年1月～2005年12月经病理确诊为乳腺癌的手术根治标本30例，术前均未化疗、放疗和内分泌治疗。年龄35～75岁，中位年龄48岁，均为女性。其中浸润性导管癌18例，浸润性小叶癌13例。其中伴腋窝淋巴结转移者13例，不伴腋窝淋巴结转移者17例，上述标本直接取自手术切除物，取癌组织及距肿瘤＞5 cm正常乳腺组织各01 g，每份标本均取2份，1份取材后立即置液氮速冻后，-80℃冰箱保存备用。另一份标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

12 细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF7、MDAMB231取自我院科研中心细胞库。其中MCF7为ER阳性细胞，MDAMB231为ER阴性细胞。常规传代培养，培养基：MEM，用10% 胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、含5%CO2的温箱中培养，待细胞接近融合时用含025%胰酶消化，取细胞悬液离心，用DHank′s洗涤2次再离心后得到沉淀细胞，经台盼蓝染色检测活细胞百分率在95%～100%待用。

13 方法

131 syk表达的检测（免疫组织化学法）

1311 细胞爬片的制备 将密度为1×105的细胞悬液，接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内，24 h后吸去培养液，用PBS液洗3次，加入2 ml丙酮固定4 min，取出盖玻片，晾干，黏于载玻片上。

1322 组织标本的处理 取患者瘤体和正常胰腺组织标本（经10%福尔马林溶液固定）进行常规病理切片，切片常规脱蜡至水。

1323 染色步骤 用PBS冲洗5 min×3次，用03%过氧化氢甲醇溶液室温下作用10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。每张切片加5 ml 10%山羊血清封闭10 min，倾去血清，滴加50 ml（1:300稀释）兔抗syk抗体，反应60 min，用PBS冲洗5 min×3次。滴加50 ml生物素标记二抗溶液，孵育20 min，用PBS冲洗5 min×3次。滴加50 ml辣根过氧化物酶标记抗链霉卵白素抗体，室温下孵育30 min，用PBS冲洗5 min×3次。每张切片滴加100 ml新鲜配置的DAB溶液显色，镜下观察显色反应。显色适度时终止反应（一般15～30 min）。流水冲洗后，蒸馏水洗一次。苏木素淡染5～10 min后，常规脱水、透明、封片。以上实验同时用PBS代替一抗作为阴性。光镜下观察结果并拍摄图像（应用Canon Powershot S70），综合分析整张切片的阳性细胞所占比例及染色强度。syk为胞浆着色，细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

132 syk表达的检测（荧光定量PCR）

1321 syk mRNA检测 采用Primer express 20软件，根据gene bank中syk的基因序列设计引物和探针。syk序列：F：5′GCAGGCAATGACGAGAACTACTC3′，R：5′CTGGCCACCTGGTTCTTCA3′，Probe：5′FAMCTGAGCTGCGCAATGCCTCGGTAMRA3′。

1322 总RNA的提取 取人乳腺癌细胞株MCF7、MDAMB231及其冻存的乳腺癌组织及正常乳腺组织各约05 g，采用Trizol(Invitrogen公司)提取组织的总RNA。逆转录成cDNA。

1323 RNA样本逆转录反应 反应体系如下：5×逆转录buffer 4 μl，上游引物 04 μl，下游引物04 μl，dNTPs 02 μl，逆转录酶 1 μl，DEPC水9 μl，RNA模板 5 μl，总体积20 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。

1324 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板浓度为1010，反应前取3 μl按10倍（加水27 μl并充分混匀）为109、108、107、106、105倍比稀释。上机时以108、107、106、105 、104五个梯度上机，反应体系如下：5×定量PCR buffer 10μl，阳性模板上游引物F 05 μl，阳性模板下游引物R 05 μl，dNTP 05 μl，阳性模板荧光探针 05 μl，Taq 酶2 μl，阳性模板DNA 5 μl，ddH2O 31 μl，总体积50 μl。

1325 检测样品的体系制备 取约500 ng～1 μg样本总RNA作逆转录反应后，再取5 μl 逆转录产物作为模板，按以下反应体系进行：5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F 05 μl，下游引物R 05 μl，dNTP 05 μl，荧光探针 05 μl，Taq 酶 2 μl，cDNA模板 5 μl，ddH2O 31 μl，总体积 50 μl。反应条件为：93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，共40个循环。所有反应信息资料被PE7700扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑（含相应的分析软件）中，反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。根据阳性定量模板和待测样本的扩增情况，计算出反应体系中待测样本中cDNA的拷贝数。根据标准曲线得出样本荧光定量反应的绝对定量值。定量的单位B=拷贝数/μl cDNA，计算结果按下列公式换算：A (拷贝数/μg总RNA) = B (拷贝数/μl cDNA)/样本RNA的OD260值×5/6。

14 统计学处理 数据计量资料用x±s表示，两组样本间均数比较采用独立样本t检验（并做方差齐性检验）。

2 结果

21 syk mRNA检测（荧光定量PCR）在人乳腺癌细胞株及其乳腺癌组织及其正常组织中的表达 人乳腺癌中syk mRNA的标准曲线中，阳性模板以108、107、106、105梯度上级检测的标准Ct值分别为：1384、1741、2134、2455。人乳腺癌细胞株MCF7中sykK mRNA表达为阳性，定量为659×105，Ct值为1910；MDAMB231的syk基因mRNA为阴性。乳腺癌组织syk mRNA表达阳性率为633%（19/30）和正常乳腺组织中syk mRNA表达阳性率为933%(28/30)。乳腺癌癌组织syk mRNA的平均水平为（617±0065）×104（平均Ct值3005），其明显低于配对的癌旁正常乳腺组织（803±0125）×104（平均Ct值2872）(P＜001)(表1)。

表1 两种方法检测syk表达的比较（略）

22 SYK蛋白（免疫组织化学法）在人乳腺癌细胞株及其乳腺组织中的表达 人乳腺癌细胞株MCF7中SYK蛋白表达为阳性；MDAMB231的SYK蛋白为阴性。乳腺癌患者中SYK蛋白在乳腺癌及其癌旁正常组织表达阳性率分别为60%（18/30），90%(27/30)(P＜001)(图1)。

23 SYK表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 syk的mRNA和蛋白表达的下调与乳腺癌临床TNM分期、腋淋巴结转移显著相关(P＜005)，而与肿瘤的大小、病例分级、ER和PR状况无关(P＞005)。发生远处转移的5例乳腺癌浸润性导管癌，其中4例syk表达缺失，占80%（表1）。

图1 乳腺组织中SYK的表达（略）

表2 syk基因在乳腺癌组织的表达及其临床特征意义（略）

24 乳腺癌患者SYK蛋白表达与syk mRNA一致率 两种方法检测的一致率为86%。

3 讨论

乳腺癌的发生和发展是一个多因素、多突变积累的、复杂的多步骤的过程，包括原癌基因的激活（如HER2/neu）和抑癌基因的突变或丢失（如p53）等〔3〕。几十年来，对乳腺癌的发生、发展和转移过程中的基因改变和功能研究一直是该领域研究的焦点。酪氨酸激酶是乳腺组织细胞的信号传导中起关键作用的一种蛋白质，在多数乳腺癌组织中酪氨酸激酶HER2/neu呈过度表达状态，与肿瘤的生长和发展密切相关〔4〕。一种新的酪氨酸激酶Syk是乳腺癌细胞生长和转移中重要的抑制因子，被认为是一种候选抑癌基因，对其相关研究也越来越多〔5～8〕。

由于免疫组化方法是个定性的实验方法，我们应用的SYK抗体仅能判定阳性和阴性，虽然也有文献报道免疫组化方法可应用染色结果半定量分析，但是应用真彩色图像分析仪检测是在测试前人为的设定对照数值标准，并不能很好的客观的对染色<