【摘要】 目的： 观察蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）βΙ与周期蛋白D1（cyclin D1）在乳腺癌组织中的表达状况，探讨癌细胞信息传递的分子生物学机制。方法： 应用半定量RTPCR检测31例乳腺癌组织与12例癌旁正常乳腺组织中PKCβΙ mRNA表达；应用Western blot和免疫组化法检测以上组织中PKCβΙ蛋白与cyclin D1表达。 结果： 乳腺癌组织中PKCβΙ mRNA与蛋白表达均高于癌旁正常乳腺组织（P<0.01）；癌组织cyclin D1表达阳性率高于癌旁正常乳腺组织（P<0.05）。 结论： 乳腺癌组织中存在PKCβΙ同工酶过度表达，它可能介导乳腺癌细胞分化的信号转导过程。cyclin D1与细胞恶性增生密切相关。

【关键词】 乳腺癌蛋白激酶C－βΙ周期蛋白D1表达

Expression of protein kinase CβΙ and cyclin D1 in human breast cancer

LI Jianping， ZUO Keqiang

Department of Biochemistry，Basic Medical College， Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China

［Abstract］ Objective: To investigate the expression of protein kinase C(PKC) isoenzymes and cyclin D1 in breast cancer. Methods： The expression of PKCβΙ was detected by semiquantitative RTPCR and Western blotting and Immunochemical method in 31 cases of breast cancer and 12 cases of normal tissues. Results： PKCβΙ mRNA and protein and cyclin D1 were markedly increased in cancer tissues compared to normal tissues (P<0.01， P<0.05). Conclusion： Overexpression of PKCβΙ played an important role in regulating cellular proliferation of breast cancer. cyclin D1 was found to be closely associated with cell malignant hyperplasia .

［Key words］ breast cancer； protein kinase CβΙ； cyclin D1； expression

细胞增殖呈周期性变化受到精密的调控，周期蛋白（cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase， CDKs）是细胞周期的正调节因子，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）作为信号分子，是一类依赖于钙、磷脂和二酰甘油激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞生长调控信息通路的重要组成成分，参与细胞多种生理功能的信号转导，如转录调节、免疫介导、细胞生长、分化、增殖、癌变及细胞凋亡过程。

迄今为止已从不同种属的器官分离纯化出12种PKC同工酶，每种同工酶有特异的底物及激活剂，并可能介导了不同的信号传递，PKC各种同工酶的功能如今还在争论和研究中［1］。为探讨PKCβΙ与cyclin D1在乳腺癌细胞增殖、分化及信息传递的分子生物学机制，我们应用半定量RTPCR、Western blot和免疫组化法研究cyclin D1与PKCβΙ同工酶在乳腺癌组织中的表达。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集河北医科大学附属第四医院外科2005年3月～2005年5月确诊原发乳腺癌而未做放疗和化疗的患者癌组织标本31例，年龄30～50岁，取距癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织、经病理证实无肿瘤细胞浸润、无明显炎症病变乳腺正常组织标本12例，取一部分立即经液氮冷冻后，保存于-80 ℃超低温冰箱内。另一部分用10％甲醛固定，免疫组化备用。

1.2 主要试剂与仪器

反转录试剂盒（Promega公司），Western blot 用的PKCβΙ兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的二抗和DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，华美生物公司），考马斯亮蓝检测试剂盒（南京建成生物工程所）， cyclin D1 鼠抗人单克隆抗体、克隆系为4C5，单克隆抗体及免疫组化试剂盒（美国ZYMED公司）。-80℃超低温冰箱和低温高速离心机（美国Thermo Forma公司），PCR仪（德国Eppendorf公司），凝胶成像分析仪（法国Vllber Lourma公司）。

1.3 RTPCR半定量检测PKCβΙ mRNA表达

取乳腺癌或癌旁正常乳腺组织100 mg，剪碎后加1 ml Trizol置玻璃匀浆器内，用液氮匀浆10 min，按照Trizol试剂说明程序提取细胞总 RNA， 取1 μg RNA经反转录酶在下列条件下合成cDNA：25℃ 5 min，40℃ 60 min，75℃ 15 min。然后用该cDNA作为模板进行PCR反应。PKCβΙ上游引物：5′CTT TGG CAT GTG TAA AGA GAA TAT CTG GGA3′；下游引物：5′GTC GAA GTT GGA GGT GTC TCG CTT GTC TCT3′，扩增片断长度为442 bp，内参照用GAPDH上游引物：5′CCA ATA TGA TTC CAC CCA TG3′，下游引物：5′AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT3′，扩增片断长度为594 bp，由北京赛百胜基因技术公司合成。扩增条件如下：94℃ 2 min，94℃ 40 s、55℃ 60 s、72℃ 40 s进行30个循环，72℃延伸10 min终止反应。将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析仪中摄影，采用1 D图像分析系统（BIOPROFIL Bio1 D Windows Application V10.02）测光密度值，用PKCβΙ与GAPDH光密度的比值代表PKCβΙ的相对含量。

1.4 Western blot检测PKCβΙ蛋白表达

从-80℃冰箱中取出保存的组织100 mg，剪碎后加入细胞裂解液（50 mmol/L TrisHCL pH7.4，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L Na2EDTA，0.5% NP40，0.5% TritonX100，0.1% SDS、临用时现加蛋白酶抑制剂：1 mmol/L PMSF、1 mmol/L Leupeptin，1 mmol/L Aprotinin，1 mmol/L Pepstain），置玻璃匀浆器中，用液氮匀浆10 min，4 ℃裂解1 h， 4 ℃ 12 000 r/min离心60 min，吸取上清液，用考马斯亮蓝检测蛋白浓度。取100 μg总蛋白进行8％ SDSPAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，TBST液漂洗3次，加入PKCβΙ多抗（1∶600），4 ℃孵育过夜，TBST液漂洗3次，加辣根过氧化酶标记的相应二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，TBST液再次漂洗后，DAB显色，凝胶成像分析仪中摄影，采用1 D图像分析系统扫描体积后，用PKCβΙ蛋白与内参照βactin的比值代表PKCβΙ蛋白的相对含量。

1.5 免疫组化检测cyclin D1蛋白表达

采用免疫组化ZYMEDpic TureTM二步法，标本常规石蜡包埋，制成连续4 μm切片2张，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3％ H2O2消除内源性过氧化物酶活性，高温抗原修复，加入一抗为小鼠抗人cyclin D1单克隆抗体，应用浓度为1∶100，湿盒内4℃孵育过夜，滴加polymer Help试剂，加poly peroxidaseantimouse/rabbit IgG试剂，DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片。光镜下观察结果，细胞核有棕黄色颗粒着色为cyclin D1表达阳性反应，细胞无棕黄色或背景一致的浅棕黄色为阴性。随机观察10个高倍视野记数，每个视野记数100个细胞，根据阳性细胞数所占比例判断结果。

1.6 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件进行分析。半定量RTPCR和Western blot结果用均数±标准差（±s）表示，进行t检验。免疫组化结果用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌与癌旁组织PKCβΙ mRNA表达的比较

乳腺癌组织中PKCβΙ mRNA表达水平高于癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义（t=5.017，P<0.01），见表1，图1。表1 乳腺癌及癌旁组织PKCβΙ mRNA与蛋白表达的比较（略）

2.2 乳腺癌与癌旁组织PKCβΙ蛋白表达的比较

乳腺癌组织中PKCβΙ蛋白表达高于癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义（t=3.763，P<0.01），见1，图2。

2.3 cyclin D1蛋白表达结果

cyclin D1蛋白阳性物定位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状。12例癌旁正常乳腺组织中，仅2例（16.67%）cyclin D1蛋白阳性。31例乳腺癌组织中24例（77.42%）cyclin D1蛋白表达阳性。乳腺癌组织cyclin D1蛋白明显高于癌旁正常乳腺组织（χ2=13.375，P＜0.05）。

3 讨 论

PKC同工酶是细胞磷脂酰肌醇信号转导途径的重要物质，根据其结构与相应激活剂的异同将其分为三类：cPKCs(classical PKC)由α，βΙ，βⅡ，γ组成；nPKCs(novel PKC)由δ，ε，η，θ，μ组成；aPKCs(atypical PKC)由ζ，λ，ι组成。某些癌基因的表达会明显改变PKC同工酶的含量及在细胞内的分布，研究证明PKC是促癌物质PMA（phorbol，12myristate13acetate，即佛波醇12豆蔻酰13乙酸）的细胞内受体，PMA可直接激活PKC，促进细胞全部或部分依赖PKC信号通路，跨越其遗传学及生化学改变阶段，进入形态改变期，触发肿瘤的形成［2］。可见PKC在细胞恶性变过程中起重要作用。

对于不同类型的癌组织，各种PKC同工酶的活性不同所起的调控作用各异，PKCα蛋白表达增