【摘要】 目的 本研究旨在通过检测血管内皮细胞生长因子（VEGF），基质金属蛋白酶9(MMP9)在乳腺癌细胞中的表达情况及计数微血管密度(Microvascular density, MVD)值来探讨它们与乳腺癌浸润和转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测75例乳腺浸润癌 (有淋巴结转移者39例,无淋巴结转移者36例) 中VEGF、MMP9、CD34的表达，并用多因素COX比例风险模型分析患者的预后。结果 VEGF 、MMP9 和MVD在淋巴结转移组与无转移组的表达均具有显著性差异（P<0.05）, 与乳腺癌淋巴结转移呈正相关。MVD值高者生存时间短。结论 乳腺癌淋巴道转移与VEGF、MMP9表达及MVD值有关，检测这几种蛋白表达将有助于判断乳腺癌的转移潜能及预后。

【关键词】 乳腺肿瘤 淋巴道转移 血管内皮细胞生长因子 基质金属蛋白酶9 微血管密度

乳腺癌早期转移的主要途径为淋巴道，癌细胞转移至淋巴结形成转移灶后不但可以造成局部组织的破坏，而且能够在淋巴结中隐匿，成为其他脏器转移的发源地。因此探讨乳腺癌淋巴道转移的相关因素对有效遏制其远隔转移、判断预后及选择治疗方案均具有重要意义。癌细胞诱导血管生成和降解细胞外基质都是完成转移的关键步骤。 血管内皮细胞生长因子( Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)是一种选择性促内皮细胞有丝分裂原，能促进血管新生，为肿瘤转移提供条件。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）可以降解多种细胞外基质，帮助肿瘤细胞突破基底膜屏障，进出脉管完成转移，同时也有利于血管的生成。本实验利用免疫组织化学方法检测了乳腺癌细胞中VEGF、MMP9的表达情况，并用CD34标记血管内皮细胞，计算微血管密度（Microvascular density，MVD），探讨它们与乳腺癌肿瘤细胞浸润及转移的相关性，旨在为判定该肿瘤淋巴道转移潜能及有效治疗这一肿瘤提供一些理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

75例乳腺癌组织选自1987～1993年大连医科大学附属第二医院存档石蜡包埋标本，其中无淋巴结转移者36例，有淋巴结转移者39例。患者年龄24～70岁，中位年龄53岁，均为女性，获取可用于实验的癌转移淋巴结24枚。所有病例均为乳腺浸润癌，依据WHO分类，其中浸润性导管癌61例（腺癌18例；实体癌43例，其中单纯癌35例，硬癌3例，不典型髓样癌5例），浸润性小叶癌5例，其他类型9例（髓样癌3例，粘液癌3例，透明细胞癌2例，腺样囊性癌1例）。依据《阿克曼外科病理学》进行临床分期。患者术前未经任何抗肿瘤治疗，术后放、化疗时间不等，所有标本均采用HE染色，光镜观察的基础上依据《肿瘤病理学》标准进行组织学分级[1]，并选择细胞生长状况良好部位进行免疫组织化学染色。随访时间72～121个月，随访率为64%（48/75），中位生存时间72个月。

1.2 试剂

抗MMP9单克隆抗体（ZM0335, 北京中山公司，工作液）；抗VEGF单克隆抗体（IBL公司，日本，稀释度1∶100）；抗CD34单克隆抗体（ZM0046, 北京中山公司，稀释度1∶100）

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色 将标本制成4～5μm的连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，微波抗原修复（解冻档10min，切片放入pH为6.0的枸橼酸缓冲液中）。采用SP法染色（按说明书），DAB显色。苏木素复染。取已知阳性组织作阳性对照，以PBS代替一抗作空白对照。

1.3.2 结果判定 阳性表达以细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒为准。计数5个高倍视野或1 000个细胞。按染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。按阳性细胞所占百分比计分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞11%～50%，3分为阳性细胞51%～75%，4分为阳性细胞>75%。染色强度与阳性细胞所占百分比乘积3～5分记为（+），6～9分为（++），12分为（+++）。各指标≥6分为高表达，＜6分为低表达。CD34结果判定以血管内皮细胞的细胞质内或细胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性，不着色者为阴性。在显微镜低倍视野下于肿瘤细胞浸润区域选取微血管内皮细胞染色清晰，背景对照良好，数量最密集的3个视野，在200倍视野范围分别计算所有染色的微血管，单个内皮细胞着色亦作为一个计数单位，不论是否形成血管管腔或管腔内有无红细胞。取3个视野的平均值作为MVD值，结果进行统计学处理。

1.3.3 统计学处理 分析各蛋白表达与肿瘤淋巴结转移情况，患者年龄、肿瘤大小、组织学类型、组织学分级和临床分期的相互关系及各蛋白在淋巴结转移组原发灶与转移灶中表达的关系，采用成组设计两样本比较（MannWhitney Test）秩和检验，多个样本比较（KruskalWallis）秩和检验，MVD平均值采用两样本比较t检验。各蛋白表达的相关性采用Spearman等级相关检验。多因素COX比例风险模型（Multivariable Cox proportional hazards model）分析各因素对生存期的影响，所有数据处理均应用SPSS10.0进行运算。

2 结 果

2.1 蛋白表达情况

VEGF除在癌细胞细胞浆表达外，在部分癌旁上皮及血管内皮细胞也有表达，表达较强的部位主要位于肿瘤细胞浸润区域。VEGF 在淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。

MMP9以细胞浆着色为主，在条索状癌巢癌细胞的表达强于实团状癌巢。MMP9在淋巴结转移组的表达明显高于无转移组（P<0.05）。

VEGF、MMP9表达随着临床分期及组织学分级的增高而加强，但未见显著差异，在其他各病理因素分组之间无显著差别，见表1。

CD34表达于血管内皮细胞，染色程度均匀一致，微血管分布呈异质性，微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位，见图1～3。MVD值在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（P=0.001），而在其他各病理因素分组间无显著差别，见表2。表1 乳腺癌患者淋巴结转移与癌细胞中VEGF、MMP9表达强度的关系表2 乳腺癌患者淋巴结转移与MVD值之间的关系

2.2 乳腺癌中各蛋白表达的相互关系

MMP9和VEGF蛋白表达呈正相关（r =0.579,P<0.01）。MMP9表达和MVD值呈正相关（r =0.240,P<0.05）。VEGF高表达者MVD值高。

2.3 生存分析

将VEGF、MMP9、MVD值、淋巴结转移、年龄、肿瘤大小、乳腺癌组织学类型、组织学分级及临床分期9个因素建立多因素COX比例风险模型，其中淋巴结转移、MVD值和年龄是相关的预后因素，有淋巴结转移、年龄大、MVD值高者生存期短。

3 讨论

肿瘤生长与转移的先决条件为血管新生，而血管的新生依赖于促血管生成因子的作用。VEGF是促血管生成因子中最重要的一种，缺氧是VEGF分泌的刺激因素，肿瘤生长较快的部位常出现缺血区，此时VEGF的表达增强，促进了血管新生。关于VEGF是否在内皮细胞表达争论不一，本实验中VEGF除在癌细胞表达外，在部分血管内皮和癌旁上皮也有表达，可以认为VEGF是以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞促进其增殖的。实验中淋巴结转移组乳腺癌VEGF的表达水平显著高于无转移组，提示癌细胞通过产生VEGF促进微血管形成而使其容易完成淋巴结转移。血管生成是肿瘤体积增加的基础, 同时血管增多及通透性增强也增加了肿瘤细胞进入血管的机会，从而使肿瘤细胞容易通过静脉淋巴管吻合处从血液循环中进入淋巴管，所以肿瘤淋巴结转移的概率随着血液循环中肿瘤细胞的增加而增高，因此，肿瘤血管生成对淋巴结转移具有间接促进作用 [2] 。淋巴结转移灶中VEGF的表达水平高于原发灶，表明转移到淋巴结的癌细胞具有较强的VEGF分泌能力，可以促进转移灶中血管的形成，这也是癌细胞能够在淋巴结中增殖并进一步转移的前提。有研究认为血管生成因子可能对淋巴管内皮细胞同样具有促分裂和增殖作用，诱导“淋巴管形成” [3] ，这可能是VEGF促进淋巴道转移的原因。

许多学者用MVD值反映肿瘤的微血管形成程度和肿瘤的生物学特征。本实验中MVD值在转移组高于无转移组，说明乳腺癌中较多的微血管生成为转移提供了方便。瘤体边缘的MVD值高于瘤体中央部位，表明此处微血管的增多可为肿瘤细胞的浸润提供必要的营养。VEGF表达虽与MVD值之间无显著相关性，但VEGF高表达者MVD值也较高，符合两者间的因果关系。

MMP9可以降解构成癌侵袭天然屏障的基底膜Ⅳ型胶原。本实验中淋巴结转移组MMP9表达水平明显高于无转移组，提示MMP9高表达者容易发生淋巴道转移。淋巴结转移灶中癌细胞的MMP9表达也比较强，甚至高于原发灶，有理由认为肿瘤原发灶中MMP9分泌能力强的癌细胞容易发生转移，并且有机会在淋巴结浸润完成锚定。

实验结果显示MMP9与VEGF表达及MMP9 表达与MVD值之间均具有显著相关性，这与文献报道一致 [4] 。有报道发现一些与微血管生成相关的生长因子可以诱导MMPs的表达，分析VEGF可能也发挥了同样的作用。新生血管的形成不仅需要血管基底膜的降解，而且需要降解细胞外基质蛋白[5]，基底膜和基质的降解对血管生成所必须的内皮细胞迁移极为重要。MMP9能够降解基底膜糖蛋白及细胞外基质成分，因此MMP9也是促血管生成的因素之一。这在其他类型肿瘤的研究中