【关键词】 乳腺肿瘤

关键词: 乳腺肿瘤;DNA，血浆;突变，p53基因

摘 要:目的 探讨血浆循环核酸p53基因突变检测的可行性，研究乳腺癌患者循环核酸p53基因突变对于乳腺癌发生、发展和预后估计的临床意义. 方法 应用聚合酶链反应（PCR）扩增p53基因外显子5～8，并用变性高效液相色谱技术（DHPLC）分析产物突变情况，再与各生物学参数进行了相关研究. 结果 33例患者中14例（42.4%）p53基因突变，且突变率与组织分化级别、ER阴性显著相关（P<0.05），与临床分期和淋巴结及远处转移情况无关. 结论 DHPLC可作为一种快速简便的基因突变检测手段，p53基因突变在乳腺癌循环核酸中有较高的检出率并预示肿瘤的恶性程度，血浆基因突变有望成为简便的预后参考指标.

Plasma DNA p53gene mutation in primary breast cancer patients

LU Shao-Min，WANG Hai-Dan，SI Xiao-Ming，ZHANG Yan-Jun，ZHANG Liang，PAN Bo-Rong，REN Jun

Center of Clinical Oncology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China

Keywords:breast neoplasms;plasma DNA;p53gene;muta-tion

Abstract:AIM To evaluate the presence of tumor DNA in plasma and study the clinical significance of p53gene muta-tions associated with the development and prognostic signifi-cance in breast cancer.METHODS Extraction of DNA from patients'plasma and the target DNA fragments were ampli-fied by PCR.The production were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）.The mu-tation status obtained by DHPLC was confirmed by DNA se┐quencing.RESULTS The total p53gene exon5to exon8mutation rate was42.4%（14/33）.There were statistically significant associations between p53gene mutation and histo-logical grade，ER（-）（P<0.05），but no significant associa-tion was found between mutation and clinical stages or metas┐tasis.CONCLUSION P53gene exon5to8can be amplified in breast cancer patients'plasma DNA.DHPLC is an accu-rate，rapid and economic way to screen mutation in plasma DNA amplified fragment，and plasma DNA mutation detec-tion by this method offers a new approach for prognosis.

0 引言

p53基因是目前人类肿瘤中最常变化的抑癌基因，大量研究表明p53基因的丢失或突变失活与乳腺癌的发生、发展密切相关，其突变点主要集中于第5～8外显子［1］ .血浆DNA是稳定存在于血浆中的DNA片断，正常人血浆DNA水平很低，难以检测到，而恶性肿瘤患者血浆DNA含量显著增高，超过健康人10～100倍以上.恶性肿瘤患者的血浆DNA多来源于肿瘤原发灶代谢活跃的或者脱落死亡的肿瘤细胞，可较稳定地存在于血浆中，导致肿瘤患者血浆DNA明显高于正常人［2］ .本研究采用PCR及DHPLC方法对33例乳腺癌患者血浆进行DNA提取及p53基因外显子5～8的突变分析，并与测序结果对比，证实了乳腺癌血浆中可检测到p53突变，建立了一种快速、简易检测乳腺癌DNA突变的新方法，为临床的诊断、预后提供了较好的肿瘤标志.

1 对象和方法

1.1 对象 取自2001-06/2002-01在我科住院的33例术后病理确诊的乳腺癌患者，均为女性，年龄在36～67（中位年龄54）岁.浸润性导管癌29例，单纯癌4例.临床分期:Ⅰ期3例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期11例.淋巴结转移阳性24例，阴性9例.患者空腹时，用EDTA-K2 抗凝管采集静脉血2mL，立即3000g离心10min，取血浆于-20℃冰箱保存或即刻提取DNA.PCR使用DNA扩增试剂盒（美国Promega公司产品）和PTC-200智能型热循环仪（美国MJ Research，Inc产品），引物参照文献［3，4］设计，由TaKaRa公司合成.100bp DNA梯度以及琼脂糖购自华美生物工程公司，DHPLC为美国Transgenomic公司WAVETMDNA片断分析系统，色谱柱为其DNA Sep分析柱.PCR产物由上海申友公司纯化后使用自动测序仪测序.

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR反应 DNA提取参照试剂盒进行.PCR反应体系25μL（10×Buffer，2.5μL，2.5mmol L
-1 MgCl2 1μL，250mmol L-1 dNTP1μL，10μmol L-1 引物各1μL，Progema Taq酶1.5U），血浆DNA提取物3μL作为模板DNA，阳性对照模板1μL.反应体系95℃预变性3min后开始进行35个反应循环，循环结束后于72℃延伸10min，循环参数如下:exon5，6（408bp）:94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min;t-Sense为5'-TTCCTCTTCCTGCAGTACTTC-3't-AntiSense为5'-AGTTGCAAACCAGCCTGAGG-3'.exon7（133bp）:94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s;t-Sense为5'-TCTCCTAGGTTGGCTCT-GAC-3't-AntiSense为5'-CAAGTGGCTCCT-GACCTGGA-3'.exon8（193bp）:94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min;t-Sense为5'-CGT-CAAGACTT-TTCCTATCCTG-3't-AntiSense为5'-CGGTCGACCTTCTTGTCCTGC-3'.

1.2.2 DHPLC检测靶序列突变 参照文献［5］方法自动进样，每份产物进样量为8μL.体系流动相为0.1mol L-1 N-三乙基乙酰胺（TEAA，色谱纯）和不同浓度的乙腈梯度洗脱（浓度梯度由其软件系统WAVE Maker4.0根据核苷酸系列生成，流速为0.9mL min-1 ）;检测器为紫外分光光度计（波长260nm），样品在最佳变性温度下按突变方式分析.

1.2.3 DNA测序 测序样品为PCR扩增产物各100μL（DNA含量大于200ng），同时提供引物序列做DNA PCR产物直接测序分析.

2 结果

在33例乳腺癌患者的循环核酸中，p53基因热点区域第5～8外显子突变测定的结果显示有14例出现突变，占42.4%（14/33）.7/14为第5，6外显子的突 变，外显子7突变3例，外显子8突变4例.Fig1为血浆DNA p53基因外显子7扩增结果.Fig2显示第7外显子突变的测定结果.突变结果通过Fisher精确检验表明与组织分化级别、ER阴性和患者无病生存期显著相关（P<0.05）.p53基因突变在Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌为35.7%（5/14），Ⅲ/Ⅳ期为47.3%（9/19），无显著性差异（P>0.05），与患者有无淋巴结或远处转移无明显相关关系（P>0.05）.

图1 － 图2 略

3 讨论

p53基因定位于染色体17p13.1，是一重要的抑癌基因，该基因的缺失和突变已被证实是多种肿瘤的始动因素之一，与多种肿瘤的发生发展有关.其结构有5个进化上的高度保守区，多数p53基因突变是发生在这些保守区内的5～8外显子［1，6］ .有大量文献报道乳腺癌肿瘤组织中p53突变是一个经常和早期事件，其与病理分级、早期肿瘤、淋巴结转移、术后生存期及早期复发有关［7］ .Leon等在20世纪70年代就发现乳腺癌患者的血浆中存在游离DNA，其浓度与肿瘤分级和对治疗的反应有关［8］ .研究证实，乳腺癌患者较健康女性血浆中DNA浓度高得多，在乳腺癌患者中，血浆DNA水平也与组织分级、淋巴结转移有关.同时发现血浆中p53突变与临床分级、肿瘤大小、淋巴结转移及ER地位有重要意义，血浆p53突变的乳腺癌患者的生存期较短，肿瘤恶性程度高［9］ .我们采用聚合酶链式反应法扩增p53基因外显子5～8，再用变性高效液相色谱法对产物进行突变分析，并与测序结果比较.经DHPLC检测有14例发生突变，与DNA测序结果一致.进一步分析发现p53基因突变率在Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌为35.7%（5/14），Ⅲ/Ⅳ期中为47.3%（9/19），无显著性差异（P>0.05），说明p53基因突变是乳腺癌早期即存在的重要遗传学改变，可能为乳腺癌发生的重要因素.乳腺癌预后因素分析一直是乳腺癌研究的热点，特别是早期肿瘤和淋巴结转移阴性患者.本研究初步结果发现突变阳性组和阴性组患者的无病生存期差异有显著性，特别是在手术时为Ⅰ/Ⅱ期的乳腺癌患者中，也以突变阳性组患者的预后为差.但由于样本较小，尚不能认为血浆p53基因突变的检测可作为乳腺癌患者预后判断的指标.随着研究深入，特别是病例数的不断扩大和长期随访及多基因联合检测，基因突变的检测有望成为一种简便的预后判断指标.PCR联合DHPLC方法筛选p53基因突变具有操作简单、快速、灵敏等优点，适合于临床上日常的大规模推广和应用［10］ .

参考文献:

［1］Greenblatt MS，Bennett WP，Hollatein M.Mutation in the p53tumor suppressor gene clues to cancer etiology and molecularpathogenesis ［J］.Cancer Res，1994;54（18）:4855-4868.

［2］Fournie GJ，Courtin JP，Laval F，Chale JJ，Pourrat JP，Puja-zon MC，Lauque D，Carles P.Plasma DNA as a marker of can-cerous cell death:Investgation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumor ［J］.Cancer Lett，1995;91（2）:221-227.

［3］Zhu MH，Greenblatt MS，Feitelson MA.Relationship between hepatitis B virus associated primary hepatocellular carcinoma and alteration of tumor suppressor gene p53［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med<