【摘要】 目的 分析MnSOD(SOD2)基因在前列腺癌(PCa)及良性前列腺增生(BPH)组织中的mRNA表达情况，揭示氧化应激损伤在PCa发生过程中的作用。方法 应用RTPCR法分别扩增12例PCa组织及20例BPH组织中的SOD2基因片段，半定量分析其表达情况。结果 与BPH组织相比，PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平显著低下(P＜005)。 结论 SOD2基因表达低下导致氧化应激加剧在PCa的发生中可能起重要作用。

【关键词】 锰超氧化物歧化酶；前列腺癌；良性前列腺增生；基因表达；逆转录聚合酶链反应

前列腺癌(PCa) 是欧洲占第2位的常见男性恶性肿瘤,在美国则超过肺癌居首位。我国PCa发病率虽远低于西方国家，但随生活方式的改变及人口的老龄化呈显著增长趋势〔1〕。PCa发生的确切分子机制尚未阐明。近年来研究表明, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)参与肿瘤的启动和促进过程〔2〕。SOD2基因编码含锰超氧化物歧化酶 (MnSOD)，是体内主要的超氧阴离子自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。近年研究发现, SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降,提示SOD2基因为潜在的新型肿瘤抑制基因〔3，4〕。本实验采用RTPCR法探讨PCa及良性前列腺增生(Benign prostate hyperplasia, BPH)组织中SOD2基因的mRNA表达，以期为寻求PCa基因诊断、基因治疗的靶向基因提供基础资料。

1 材料与方法

11 标本的收集与处理 收集12 例PCa患者手术后的肿瘤组织标本及20例BPH患者的组织标本(标本来源于平顶山煤业集团总医院，郑州大学第一医院, 郑州大学第二医院, 河南大学第二医院)。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。所有病人术前均未行化疗。

12 方法

121 总RNA的提取 从液氮中取出标本组织，加液氮在研钵中研碎, 用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取总RNA。

122 cDNA的合成 所采用的逆转录反应体系：RTMix 9 μl (5×RT缓冲液，含50 mmol/L MgCl2)6 μl，10 mmol/L 4×dNTP 2 μl，RNasin 40 U，AMV 2 U，通用引物1 μl)，提取总RNA 5 μl，DEPC水补足30 μl，42℃水浴逆转录1 h。

123 PCR扩增 参照GenBank NM000636和NM001101，分别设计出SOD2和βactin扩增引物，由上海生工生物公司合成，经PAGE纯化。SOD2(上游)5′GTGGTGGTCATATCAATCAT 3′，SOD2引物(下游)5′GGCCTGTTGTTCCTTGCAGT3′，扩增产物长度252 bp；内参照人βactin(上游)5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG 3′，βactin(下游)5′CTTTGCGGATGTCCACGTC 3′，扩增产物长度393 bp。 扩增反应体积为30 μl：逆转录所得cDNA 5 μl, Mix (含有SOD2引物及βactin内参照引物) 6 μl，Taq酶 05 μl，去离子水 185 μl，94℃预变性 5 min，94℃变性 50 s，55℃复性50 s，72℃延伸60 s，循环35次，72℃末端延伸5 min。

124 扩增产物琼脂糖凝胶电泳 配制15%琼脂糖凝胶电泳(含EB 05 μg/ml)，取PCR扩增产物 9 μl点样电泳 ，以每cm 3 V 电泳40 min。

125 半定量结果分析 使用英国SYNGENE 凝胶成像分析系统，对扩增产物的电泳条带进行灰度扫描，分析测定积分吸光度值(IA)。每例标本SOD2基因mRNA的相对表达量以SOD2片段的IA/βactin的IA比值来表示。

13 统计学处理 采用SPSS100统计学软件。

2 结果

21 PCa及BPH组织中SOD2和βactin基因RTPCR结果 引物SOD2基因扩增片段为252 bp,βactin为393 bp，经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段见图1。

M:分子量Marker；1、2为PCa组织的SOD2及βactin基因扩增条带;3、4为BPH组织的SOD2及βactin基因扩增条带

图1 SOD2基因的mRNA表达（略）

22 PCa及BPH组织中SOD2基因的mRNA表达量分析 根据RTPCR半定量结果，每份标本取其两次数据平均值，计算出其表达值。PCa 及 BPH中SOD2基因的mRNA表达水平分别为045±011和178±034，PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平较BPH组织显著低下(P＜005)。

3 讨论

SOD为体内以O2·为唯一底物的天然酶类清除剂和自由基连锁反应的阻断剂，在保护细胞免受ROS的氧毒性损伤中发挥着重要作用。真核生物中主要含有CuZnSOD和MnSOD两种同工酶。SOD2基因编码MnSOD为存在于真核细胞线粒体基质中的一种抗氧化酶。线粒体氧化呼吸链电子传递过程是体内活性氧自由基产生的最主要途径, MnSOD可首先清除这些自由基以防止自由基的累积和扩散, 因此MnSOD基因的表达和调控对机体内自由基清除的平衡体系至关重要。ROS还作为机体重要的信号分子，参与调控细胞的分化、增殖和凋亡等一系列生命活动, 与肿瘤的发生密切相关。研究认为MnSOD是一种新的肿瘤抑制因子，MnSOD的基因表达与肿瘤的分化程度和恶性表型相关。用基因转染的方法, 转染人MnSOD的正义cDNA, 使MnSOD过表达, 可抑制或逆转人恶性黑色素瘤细胞、神经胶质瘤和SV40转化肺成纤维母细胞系的恶性表型及生长〔5～8〕。本研究结果显示, PCa组织中SOD2基因的mRNA表达水平较BPH组织显著低下, 提示MnSOD的下调表达导致的氧化应激加剧在PCa发生中亦起重要作用, 这为PCa的基因诊断和治疗提供了一个重要的靶向基因。但关于MnSOD参与肿瘤发生的机制, Huang等认为肿瘤细胞MnSOD表达下降, 导致细胞线粒体内ROS增加, 高浓度的ROS则可导致DNA损伤及基因不稳定性增加, 有助于肿瘤的发生和转化, 促进细胞增殖〔9〕。MnSOD基因序列启动子的突变及MnSDO的酪氨酸硝酸化也是导致癌组织MnSOD表达低下的重要因素〔10〕。此外, MnSOD表达异常可改变细胞内包括O2·在内的ROS的净水平, 后者作为细胞内重要的信号分子, 调节某些转录因子活性及基因表达,从而使调节细胞增殖的信号转导通路发生改变, 可能是MnSOD关联肿瘤发生的另一分子机制〔11〕。

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11 Zhao Y, Xuo Y, Oberley LW, et alOverexpression of manganese superoxide dismutase suppresses tumor formation by modulation of activator protein1 signaling in a multistage skin carcinogenesis mode〔J〕Cancer Res, 2001；61916:60828