【摘要】 目的： 筛选食管癌中差异表达的基因，为进一步了解食管癌发生的分子机制奠定基础。方法： 利用荧光差异显示技术（DDPCR）获得差异片段，对这些片段进行克隆和序列分析。通过在GenBank中同源性检索，查找差异片段相对应的同源基因。利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性，并对该基因的结构进行预测和分析。结果： 通过DDPCR得到差异片段中的一个片段对应于人类钙结合蛋白1基因(Cabin1)。荧光定量PCR技术检测结果表明钙结合蛋白1基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织，在食管癌细胞株TE1中的表达量高于其他被测试的5种肿瘤细胞株。生物软件分析表明：该基因的读码框长6 663bp，编码2 220个氨基酸，至少有4种剪切方式。 结论： Cabin1在食管癌组织及食管癌细胞中异常表达，可能在食管癌发生过程中起着重要的作用。

【关键词】 荧光差异显示钙结合蛋白基因定量PCR食管癌

Sequence analysis and its significance of calcium bindingprotein 1 gene expressed highly in esophageal cancer

WEN Yan, WANG Wenbing， GAO Guang, XU Wenrong, ZHU Wei， Li Feng

(Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013；National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai, 200032；School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013；Department of Cardiothoracic Surgery, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013)

［Abstract］ Objective: To further investigate the molecular mechanism of esophageal carcinogenesis and screen out the genes expressed differently in esophageal cancer. Methods： mRNA differential display (DDPCR) was employed to search differently expressed fragments, some of which were cloned and sequenced. By homology analysis in GenBank, corresponding homologous genes of those fragments were found. The corresponding genes of those differently expressed fragments were validated by Realtime quantitative PCR. Results： By DDPCR, one EST was identified to be calcium binding protein 1(Cabin1). The result of realtime quantitative PCR showed that the expression level of Cabin1 in esophageal cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues, and its expression level in esophageal cancer cell line was also higher than that in five other cancer cells from lung cancer and Leukaemia. The ORF of Cabin1 was 6663 base pair long and encodes 2220 amino acids, and the gene had at least four splicing forms. Conclusion： The overexpression of Cabin1 in esophageal cancer may indicate an important role in esophageal carcinogenesis.

［Key words］ fluorescent differential display(FDD); calcium binding protein;realtime quantitative PCR; esophageal cancer

食管癌是我国最常见的癌症之一，5年生存率低于10 %［1］。目前普遍认为食管癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病［2］。然而其发生和发展的确切机制仍未阐明。寻找食管癌中表达特异的基因对食管癌的基础研究与临床研究有重要意义。

荧光差异显示(DDPCR)技术具有简便、灵敏、省时等优点，已广泛应用于寻找表达特异基因的研究中［3］。本试验应用DDPCR筛选食管癌中差异表达的基因，利用荧光定量PCR验证了一个功能未知基因钙结合蛋白1基因（Cabin1）表达的差异。同时，应用生物信息学方法对该基因进行了功能预测分析，为进一步阐明该基因在食管癌发生过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

食管癌的癌组织及癌旁组织取自江苏大学附属医院，6株肿瘤细胞95D（高转移肺癌）、AGS（胃腺癌）、LTEPa2（肺腺癌）、SGC（胃腺癌）、TE1（食管癌）和U937（白血病细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MMLV反转录试剂盒购于Promega公司；荧光差异显示试剂盒购于HIEROGLYPH 公司；荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

1.2 细胞培养和cDNA的制备

试验所选用的6种肿瘤细胞用DMEM (Invitrogen)加10 %小牛血清，CO2培养箱中37 ℃恒温培养细胞均匀覆盖细胞瓶约3/4。

以Trizol提取的方法提取食管癌组织、癌旁组织及6种肿瘤细胞的总RNA并纯化, 用MMLV反转录得到食管癌、癌旁组织和6种肿瘤细胞的cDNA。

1.3 DDPCR

3种荧光引物（FHT12A,FHT12G,FHT12C）与20种试剂盒中的随机引物做不同组合，进行荧光差异显示PCR（DDPCR），PCR产物8 μl上样于6%的聚丙烯酰胺凝胶，1 200 V恒压电泳4 h左右。

1.4 差异片段的克隆

差异条带经切割和处理后作为模板，进行二次PCR，将产物连接于T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切鉴定后测序（上海鼎安测序公司）。

1.5 荧光定量PCR分析

利用DNAstar软件设计用于定量PCR的Cabin1基因引物，内参选用人βactin （GenBank登录号：AK225414），检测Cabin1基因在食管癌组织、癌旁组织以及6种肿瘤细胞中表达的差异。引物序列为：Cabin1：5′GTTCCATCTTTATTAGAAAAGCAACCG,3′GCCATCTGCACGCCAGG;内参βactin：5′GAGACCTTCAACACCCCAGCC，3′GGAGTACAGGTCTTTGCGGATG。扩增片段长度分别为182 bp和512 bp。反应条件为94℃ 40 s, 58℃ 35 s, 72℃40 s。根据2ΔΔCt公式计算基因相对拷贝数［４］ ，利用SPSS 13.0软件对获得的数据进行分析。

2 结果

2.1 食管癌和癌旁组织及6种肿瘤细胞总RNA的提取

提取的总RNA进行凝胶电泳结果显示，28S和18S条带较为明显，总RNA的完整性和质量较好。为进一步证实，采用Gene Spec Ⅲ检测，A260/A280值均在1.9 ～2.0之间，结果与电泳结果一致，各项指标均达到反转录要求。

2.2 荧光差异显示结果及阳性差异片段的筛选

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，食管癌组织和癌旁组织中基因的表达存在差异性，这说明食管癌的发生可能与某些基因的差异表达相关。差异片段切出后克隆测序。阳性克隆进行测序，序列在NCBI上进行比对，其中编号为726 的差异片段与GenBank中的钙结合蛋白1基因（Cabin1）同源性达到98%（GenBank登录号：NM_012295）。

2.3 荧光定量PCR分析

对Cabin1基因在肿瘤组织及6种肿瘤细胞中的表达量进行检测，应用SPSS13.0软件分析定量结果。Cabin1在食管癌组织中的表达量高出癌旁组织12倍（图 1）；Cabin1基因在食管癌细胞系中的表达量高于其他来源的肿瘤细胞系，有统计学意义(P<0.05)，最大的差值达8倍以上(图2)。

图1 Cabin1基因在癌旁组织及癌组织中的表达比较（略）

2.4 Cabin1基因同源性分析

在GenBank中登录了6种生物的钙结合蛋白（表1）。这6个物种Cabin1差异较大，可能是亲缘关系的远近造成。其中来自哺乳动物的Cabin1的肽链长度相近，在2 000个氨基酸残基左右，而来自较低等的生物的CABIN1的肽链长度较短，只有400个氨基酸残基左右（表1）。同源性分析表明人类的Cabin1与家鼠的最高，高达88.7%（图3）。钙结合蛋白的同源性分析表明，在基因的5′端同源性较低，中部的同源性较高，可能是钙结合蛋白的保守区域。

图2 Cabin1基因在6种肿瘤细胞的表达比较（略）

表1 不同生物来源的钙结合蛋白（略）

图3 6种不同来源的Cabin 1的氨基酸同源性分析（略）

应用ExPASy Proteomics Server对Cabin 1基因进行初步分析。结果表明，该基因表达产物具有6个TPR(tetratricopeptide repeat)基序，形成3个串联簇。这些重复单位与转录阻遏或细胞周期的调控密切相关。该蛋白还含有6个N端糖基化位点，一个亮氨酸锌指结构和热休克蛋白70（Hsp70）的结合位点，多个蛋白激酶磷酸化位点和钙结合位点等功能基团。

3 讨论

食管癌是常见的恶性肿瘤，被认为国内十大癌症死因之一。其症状主要有进行性下咽困难、食管反流和食管气管瘘，甚至呼吸困难昏迷等。这些症状的出现大多已至肿瘤发生的中晚期。此时主要是通过手术切除或放射性治疗，给病人带来极大的身体伤害，治疗效果较差，治愈率也很低。因此，在分子水平研究食管癌的早期诊断和治疗靶基因具有重要意义。