【关键词】 食管癌；逆转录聚合酶链反应；CK20；CK19；癌胚抗原；微转移

[摘要]目的：研究89例食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEA mRNA的表达，并探讨其临床病理意义。方法：巢式RTPCR技术检测89例食管癌患者术前外周血中CK20、CK19、CEA mRNA的表达。结果：89例食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEA的阳性表达率分别为49.44%、34.83%及52.81%；三基因同时检测时，至少1个基因检测结果为阳性的表达率为71.91％，与食管癌的淋巴结转移和（或）远处转移具有相关性。结论：CK20、CEA可作为检测食管癌患者外周血微转移的生物学标志，RTPCR联合检测多种标志物可为了解肿瘤的恶性生物学行为、指导临床治疗方案的选择、判断预后及监测疗效提供依据。

[关键词]食管癌；逆转录聚合酶链反应；CK20；CK19；癌胚抗原；微转移

我国是世界上食管癌高发地区之一，食管癌的死亡率仅次于胃癌。近年来尽管手术切除率不断提高，但患者死亡率仍居高不下，其原因为肿瘤的高复发和高转移率。研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就可能有癌细胞进入血液循环，而患者常无任何临床表现，普通检测手段亦不能发现，即肿瘤微转移（micrometastasis）。若能及时检测循环血中的癌细胞，将对判断肿瘤的复发转移及指导临床治疗具有重要的价值。本研究应用巢式RTPCR技术联合检测89例食管癌患者外周血中组织特异性标志物CK20、CK19、CEA mRNA的表达，并探讨其临床病理意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料随机选择东南大学附属中大医院和南京大学医学院附属鼓楼医院2000年12月到2004年9月外科收治的食管癌患者89例，所有病例经术前病理确诊且尚未化疗，术前抽取外周血。另随机收集22名健康捐献者及27例非肿瘤患者（其中反流性食管炎患者14例、腐蚀性食管灼伤患者2例、贲门失弛缓症患者9例、食管憩室患者2例）外周血为阴性对照。15例食管癌肿瘤组织为阳性对照。食管癌患者组平均年龄62.6岁（36～83岁），中位年龄65岁，男性62例，女性27例。阴性对照组平均年龄40.8岁（24～71岁），男性30人，女性19人。收集食管癌患者临床病理资料，参照UICC(2002)标准进行TMN分期。

1.2 试剂及引物淋巴细胞分离液、DEPC购自上海生工生物工程技术公司；Trizol Reagent为加拿大Sangon公司产品；逆转录PCR试剂盒及Taq酶等为TaKaRa公司产品；引物设计参照文献，由上海申友生物公司合成，见表1。

1.3 方法

1.3.1 样本处理及RNA提取 采集患者术前外周静脉血3～5ml，枸橼酸钠抗凝，2h内以Ficoll淋巴细胞分离法分离外周血单个核细胞（the peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。参照Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA，无RNA酶的DNaseⅠ去除混杂的DNA，-80℃保存待用。表1 RTPCR反应引物序列及扩增产物

1.3.2 逆转录反应和PCR 扩增 取1～2μg细胞总RNA，70℃ 6min 变性后，根据TaKaRa 逆转录试剂盒进行cDNA 第1链合成。各取4μl cDNA行第1轮PCR，取第1轮PCR反应产物0.5μl行第2轮PCR，上、下游引物各20pmol，另有10×PCR Buffer、10mmol・L-1dNTP、25mmol・L-1MgCl2及Taq polymerase（0.625U）等，反应总体积25μl。

1.3.3 结果判断 取5 μl第2轮PCR产物以1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照，在303、319、131及531bp处出现肉眼可见条带判为阳性。

1.4 统计分析用SPSS软件包分析各组数据，采用χ2检验及Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

89例食管癌患者及49例阴性对照组的外周血单个核细胞、15例食管癌患者肿瘤组织都扩增出了片段大小为531bp的内参对照β