【摘要】 目的 了解明胶酶B在食管癌浸润、转移中的作用。方法 36例食管癌患者术中取癌组织及正常组织；提取组织总RNA：用共扩增逆转录定量PCR方法测定其明胶酶B基因表达水平。结果 食管癌组织明胶酶B（MMP9）的基因表达明显高于正常食管组织；发生局部淋巴结转移者其MMP9基因表达水平明显高于无转移者。结论 明胶酶B在食管癌的浸润、转移中可能起重要作用。

【关键词】 食管肿瘤； 明胶酶B； 基因表达； 转移

Gelatinase B Gene Expression is Enhanced in Esophageal Carcinoma

Gu Caizhe ,Lu Jinfa, Zhang Li

(Department of Digestion and Respiration,the 252 nd Hospital of PLA,Baoding 071000,China)

Abstract： Objective To investigate the role of extracellular matrix degradation in esophsgeal carcinoma.Methods 36 patients with esophagus carcinoma were selected,cancerous tissue and normal esophageal mucosa tissue were obtained during operation.Total RNA was isolated and gelatinase B (MMP9)gene expression level were rneasured by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Gelatinase B（MMP9）gene expression level in esophageal cancerous tissue（1.33±0.19）was much higher than those of normal esophageal mucosa tissue（0.36±0.09）.MMP9 gene expression levels in patients with local lymph node metastasis（l.69±0.23）were higher than those of patients without local lymph node metastasis（1.13±0.17）. Conclusion Gelatinase B may play an important role in the progression of esophageal carcinoma.

Key words： esophageal carcinoma;gelatinase B;gene expression

向周围组织浸润是恶性肿瘤的典型特征；对细胞外基质的溶解是肿瘤细胞向外扩散的基础。近来的研究表明基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）在肿瘤溶解细胞外基质向外侵袭中发挥了重要作用。明胶酶B（gelatinase B，MMP9）是基质金属蛋白酶的一种，它在结肠癌中的研究已有报道，本研究旨在了解明胶酶B在食管癌浸润、转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

食管癌患者36例，男23例、女13例，平均年龄（57±9）岁。所有病例均经胃镜取材，病理检查明确诊断。每例患者均在术中取癌组织及距癌肿10 cm以上的正常组织各1块，迅速投入液氮，在标本留取一周内行RNA提取。

1.2 试剂

总RNA提取试剂盒（Total RNA Isolation System）AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig（dt）15 Primers、Taq酶、PCR Markers、琼脂糖均为Promega公司产品。

1.3 仪器

毛细管PCR 仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统；Kodak digital science system DC-40。

1.4 RNA提取

用Promega公司生产的Tota1 RNA Isolation System提取组织总PNA。RNA提取工作在标本留取后1周内进行。采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，OD260/OD280需在1.8~2.0间。

1.5 cDNA合成

采用10 μl 逆转录反应体系；含待测RNA1 μg， AMV15 U， RNA酶抑制剂20 U， Oligdt (15 Primer)50μg/ml及适量 dNTP（10mM）、 5× RT buffer，42 ℃ 反应1 h； 95℃5 min灭活 AMV。

1.6 共扩增-PCR

参照王爱民等[1]的方法进行。明胶酶 B（MMP9）引物的设计参照 Genebank资料及王爱民等[2]的设计；内参对照 β-actin的引物设计参照Genebank资料。两对引物的序列见表1，PCR 反应体系为 20 μl， 内含 cDNA2 μl， 10×buffer 2 μl，4×dNTP（2 mM）2 μl，MMP9、β-actin引物（10 μM）各2 μl，Taq 酶1 U，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃后延伸7 min。 表1 MMP9及β-actin PCR引物的序列（略）

1.7 扩增产物定量分析

扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，MMP9和β-actin的扩增产物分别为619 bp和234 bp。对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，用MMP9/β-actin的比值表示MMP9的相对表示水平。

1.8 统计学处理

数据以(±s)表示，用t检验进行处理。

2 结果

2.1 食管癌组织明胶酶B（MMP9）的基因表达水平

由表2可见正常食管黏膜组织有明胶酶B（MMP9）的基因表达；食管癌组织MMP9的基因表达水平明显高于正常食管黏膜组织（P＜0.01）。表2 食管癌组织明胶酶B（MMP9）的基因表达（略）表3 明胶酶B基因表达水平与局部淋巴结转移的关系有无局部淋巴结转移（略）

2.2 食管癌组织明胶酶B基因表达水平与局部淋巴结转移的关系。36例食管癌患者术中见局部淋巴结转移者13例，无局部淋巴结转移者23例。由表3可见食管癌患者局部淋巴结受累者明胶酶B的基因表达水平明显高于局部淋巴结未受累者（P＜0.01）。

3 讨论

明胶酶B（92 KDaIV型胶原酶和（或）明胶酶，MMP9），是IV型胶原酶和（或）明胶酶的一种；另一种为明胶酶A（72 KDaIV型胶原酶和（或）明胶酶，MMP2）； 它们降解的底物主要是明胶、IV型和V型胶原。IV型胶原是基底膜胶原的主要成份；肿瘤细胞对基底膜胶原的溶解是其向细胞外间质扩散的起始，可见可溶解IV型胶原的明胶酶B在肿瘤向外浸润中可发挥重要作用。国外学者的研究表明在原发性肺癌明胶酶B mRNA表达增强[3,4]。在皮肤鳞癌也可见明胶酶 B mRNA的明显表达[5]。在消化道肿瘤的研究中也发现结肠鳞癌明胶酶B mRNA表达明显增强[6]。目前有关食管癌患者明胶酶B基因表达的研究尚鲜有报道。我们研究了食管瘤患者明胶酶B基因表达的情况，结果表明：食管癌组织明胶酶B(MMP9)基因表达水平明显高于正常食管黏膜组织。局部淋巴结受累者MMP9基因表达水平明显高于局部淋巴结未受累者。这提示食管癌患者MMP9基因表达水平增强可能与肿瘤向周围浸润、转移有关。明胶酶B的基因表达受诸多细胞因子、生长因子的调节，如：TGFβ，TNFα，PDGF，b-FGF，EGF，IL-1β等。食管癌组织明胶酶B（MMP9）基因表达水平升高的机制目前尚不清楚，本研究是对食管癌患者MMP9基因表达的初步研究，许多问题尚有待于进一步澄清、证实。

【参考文献】
［1］王爱民,王宝恩,杨跃伟,等.实验性肝纤维化金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的动态变化[J].中华实验外科杂志,1998,15(4):352-353.

［2］王爱民，王宝恩，杨跃伟，等实验性肝纤维化明胶酶B基因表达的研究[J]解放军医学杂志,1998,23(5):461-463.

［3］Urbanski S J，Edward D R ,Maitland A,et al．Expression of metalloproteinases and their inhibitors in primary carcinomas[J].Br J Cancer,1992,66:1188-1194.

［4］Cante-Solar R, Litzky L，Lubensky，et al．Localization of the 92 kd gelatinase mRNA in squamous cell and adenocarcinoma of lung using in situ hybridization[J].Am J Patho,1994,144:518-527.

［5］Pyke C,Ralfkiaer E,Huhtala P, et al．Localization of messenger RNA for Mr 72,000 and 92,000type IV collagenases in human skin cancers by in situ hybridization[J].Cancer Res,1992,52:1336-1341.

［6］Pyke C,Ralfkier E,Trggvason K,et al．Messenger RNA for two type IV collagenases is located in stromal cells in human colon cancer[J].Am J Patho,1993,142:359-365.