【摘要】 目的 探讨食管癌组织端粒酶活性检测的意义。方法 采用TRAP结合银染分析技术检测了33例食管癌组织及相应癌旁组织，8例良性疾病组织。结果 33例中29例阳性表达，阳性率87.9％。而癌旁组织有2例阳性表达，阳性率6.1%，8例良性疾病组织均为阴性。23例有淋巴结转移的病例中22例呈阳性表达，阳性率95.6 %。食管癌组织端粒酶活性检测阳性率明显高于癌旁组织及良性疾病组织。端粒酶活性表达与癌细胞分化程度及淋巴结转移有密切关系。结论 测定食管癌组织中端粒酶活性对食管癌诊断及预后判断有重要价值。

【关键词】 食管癌；端粒酶;淋巴结转移

Signifiance of the determination of telomerase activity in esophageal cancer

YANG Li|ping,ZHANG SHu|lin,GAO San|you,et al

Department of biochemistry,Henan traditional Chinese college,Zhengzhou 450003,China

Abstract:objective To investigate the signifiance of the determination of telomerase activity in esophageal cancer.Methods Using telomeric repeat amplification protocol(TRAP)and silver staining methods,33 cases of esophageal cancer and paracarcinous tissues and 8 casea benign disease tissues were detected.Results In 33 cases of esophageal cancer ,29 cases had positive expression,the positive rate was 87.9%,2cases of paracarcinous tissues had positive expression,the rate was 6.1%,and there was no expression in 8 cases of benign disease tissues . The positive expression was also observed in 22 of the 23 cases which had lymph node metastasis, the rate was 95.6%. The positive rate of the determination of telomerase activity in esophageal cancer was higher than that of paracarcinous and benign disease tissues.The expression of telomerase activity had close relationship with the differentiated grade of cancer cell and lymph node metastasis.Conclusion The determination of telomerase activity in esophageal cancer had important value in the diagnosis and prognosis of tissues esophageal cancer.

Key words:Esophageal cancer;Telomerase; Lymph node metastasis

端粒，端粒酶与肿瘤关系受到医学界的高度重视，成为肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨端粒酶活性与食管癌发生发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本 33例食管癌组织及相应癌旁组织，8例良性疾病组织标本为1997年10月～1998年6月河南省人民医院和河南省胸科医院手术标本，经病理诊断：鳞癌29例，腺癌4例；分化程度为：高分化3例，中分化12例，低分化18例；病理分期（UICC，1987年）为：Ⅱa期10例,Ⅱb期8例，Ⅲ期15例。于手术中取食管癌组织及相应癌旁组织各1g，置于液氮中冻存。

1.2 主要试剂 TS引物：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，CX引物：5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’，均由赛百盛生物工程公司合成，CHAPS购于Sigma公司，苯甲基磺酰氟(AFBSF)，T4g32蛋白购于Serva公司，Tag DNA聚合酶购于北京京师生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 端粒酶提取 取细胞株，调整细胞数为105/ml，4℃，3000g离心10min，弃上清液，PBS清洗1次，弃上清液，加入200μl冰冻裂液(0.5%CHAPS,10mmol/L,Tris|HCL(PH7.5),1mmol/L MGCL2,1mmol/L EDTA,10%甘油,5mmol/Lβ|巯基乙醇和0.1mmol/L AEBSF),冰浴30min，然后4℃，16000g，离心20秒，小心移上清液于用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的离心管，迅速置于液氮（|70℃～|80℃）或立即检测。组织标本50～100mg，用冰冻裂解液清洗1次，于匀浆器中破碎，再加入200μl冰冻裂解液,冰浴30min，余同细胞株处理。

1.3.2 端粒酶活性检测 参照KIM等[4]略加改变，50μl PCR反应体系[20mmol/Ltris|HCL(PH 8.3),68mmol/LKCL,1.5mmol/LMgCl2,1mmol/L EGTA,0.05%Tween 20, 0.1μg TS引物,0.5μmol/L T4g 32蛋白,50μmol/L dNTPs]，加入1～2μl组织或细胞提取液，室温孵育30min。然后预热至90℃，90秒，迅速加入0.1μg CX引物，2U Tag DNA聚合酶。PCR扩增条件为94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，45秒，共35个循环。

扩增产物于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1）上电泳，175 V 45min，然后28 V，至二甲苯电泳至离胶底部5cm处，取下凝胶，银染法检测 DNA条带。

1.3.3 统计学分析 两样本率的比较采用χ2检验，以 P<0.05作为差别有显著意义的检验标准。

2 结果

食管癌组织中端粒酶表达的检测结果,见表1。23例有淋巴结转移的病例中22例呈阳性表达，阳性率95.6%。食管癌组织端粒酶活性检测阳性率明显高于癌旁组织及良性疾病组织。端粒酶活性表达与癌细胞分化程度及淋巴结转移关系,见表2。经统计学分析，端粒酶活性表达与癌细胞分化程度及淋巴结转移有密切关系，端粒酶活性与食管癌组织的分类、病理分期无相关性（P>0.05）。表1端粒酶在各组织中的表达表2端粒酶在食管癌组织中活性表达

3 讨论

端粒与端粒酶是近年来生命科学领域的研究热点之一。端粒对维持染色体的稳定性和功能具有重要作用。尤其在保护基因组DNA免受降解和有害的重组事件中起重要作用。而端粒长度的维持需要端粒酶的激活。在正常人体中，端粒酶仅在快速增生的胚胎、生殖和骨髓等细胞中检测到，而在大多数已分化的体细胞中未检测到，因而当细胞分裂到一定次数后即逐渐衰老死亡，而肿瘤细胞因发生恶性改变使端粒酶重新激活，从而维持端粒长度不再缩短，并获得永生。目前已研究的结果表明：肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌等肿瘤组织中，85%～95%均可检出端粒酶活性表达[1,2]，而与肿瘤相邻的正常组织及良性疾病中端粒酶活性仅4%表达。端粒酶的激活可能是许多恶性肿瘤增殖的先决条件[ 3,4]。端粒酶可能是肿瘤的一种标志酶。

我们检测了33例食管癌组织及相应癌旁组织，8例良性疾病组织，结果显示食管癌组织端粒酶活性检测阳性率明显高于癌旁组织及良性疾病组织。它们之间存在显著性差异。

Hiyama等研究发现，肿瘤组织中濒死性细胞端粒酶活性不表达，如果肿瘤组织中的濒死性细胞比率较增殖细胞高，则端粒酶活性表达检测为阴性[5]。另有研究发现，端粒酶活性表达与某些肿瘤组织的临床分型、病理类型、肿瘤大小、癌细胞分化程度及淋巴结转移有密切关系[6]。我们的研究结果表明：端粒酶活性表达与癌细胞分化程度及淋巴结转移有密切关系，与肿瘤组织的临床分型、病理类型无关。可以作为肿瘤的标记物。对一些临床良性表现，但具有潜在恶性变的肿瘤的发展趋势给予判断。端粒酶活性测定可作为临床预测侵袭转移和估计预后的重要参考指标之一。

我们检测的4例阴性，其中3例为Ⅱ期，未发生淋巴结转移，其愈后如何有待进一步随访观察。2例癌旁组织有阳性表达，是癌前病变？有待病理证实。

【参考文献】
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[2] 杨仕明，房殿春，罗元辉.胃癌及癌前组织中端粒酶活性的检测及其临床意义[J].中华医学杂志，1998，78（2）：207|209.

[3] Rhyu Ms. Telomere telomereas and immortality [J]. JNCI,1995,87(12):884|894.

[4] 陈鲁琦，王苏芝，陈鲁豫，等.端粒酶活性在非小细胞中表达的初步研究[J]中华医学遗传学杂志，1999，16（2）：129|130.

[5] Hiyama K,Hiyama E,Ishioka S, et al. Telomereasactivity insmall cell and non-small cell lung cancers[J]. JNCI,1995,87(12):895|902.

[6] Hiyama E,Gollahon L, kataoka T,et al. Telomeraseactivityinhumanbreasttumors[J]. JNCI,1996,88(2):116|122.