【摘要】 目的 检测胃癌DNA倍体及基质金属蛋白酶抑制因子2（TIMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）在胃癌中的表达，以探讨胃癌侵袭转移的分子基础和机制。方法 采用免疫组织化学方法检测MMP9和TIMP2在99例胃癌、16例癌周黏膜、16例胃癌远处转移灶和25例胃癌淋巴结转移灶标本中的表达情况；采用流式细胞术检测其中47例胃癌、6例癌周黏膜及4例胃癌远处转移灶标本的DNA倍体及S期分数。结果 MMP9的表达与LAUREN分型、BORRMANN分型、淋巴结转移、转移部位、浸润深度和肿瘤TNM分期有关（χ2=6.65~8.03，P<0.05、0.01）；TIMP2表达与BORRMANN分型、淋巴结转移和浸润深度有关（χ2=5.01~7.05，P<0.05）；DNA异倍体率与分化和淋巴结转移有关（χ2=5.083、11.750，P<0.05），S期分数与肿瘤大小、分化和淋巴结转移有关（χ2=4.931~6.299，P<0.05）；MMP9和TIMP2间存在正相关关系（r=0.22，P<0.05）；MMP9表达、DNA异倍体率和S期分数在胃癌与癌周非癌黏膜间表达的差异具有统计学意义。结论 MMP9和TIMP2的异常表达尤其二者间的失衡及DNA异倍体和高S期分数参与了肿瘤的演进和异质化过程。

【关键词】 胃肿瘤 基质金属蛋白酶类 基质金属蛋白酶抑制剂 DNA倍体

ANALYSIS OF DNA PLOIDY AND EXPRESSIONS OF TIMP2 AND MMP9 IN PATIENTS WITH GASTRIC CARCINOMA

ZHANG JINGFANG, ZHANG YUANPING, MIAO FANG, et al

(Department of Pathology, Taishan Medical College, Taian 271000,China)

［ABSTRACT］ObjectiveTo study DNA ploidy and expression of MMP9 and TIMP2 in patients with gastric carcinoma and explore the mechanism of invasion and metastasis of the disease. MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expressions of MMP9 and TIMP2 in specimens from 156 patients, including specimens of the carcinoma (99), of surrounding mucosa (16), of distant metastases (16) and of metastastic lymph node (25). Flow cytometry DNA ploidy and Sphase fraction (SPF) analysis was done in specimens from 57 patients, including 47 specimens of the cancer, of adjacent mucosa (6) and of distant metastatic focus (4). ResultsExpression of MMP9 was correlated with LAUREN classification, BORRMANN classification, LN metastasis and TNM stage (χ2=6.65-8.03;P<0.05,0.01). Expression of TIMP2 was significantly correlated with BORRMANN classification and LN metastasis (χ2=5.01-7.05，P<0.05). Positive correlation between MMP9 and TIMP2 was observed (r=0.22，P<0.05). The differences of expression of MMP9, the rate of DNA heteroploid and SPF were significant between cancer mucosa and noncancer mucosa.ConclusionThe abnormal expressions of MMP9 and TIMP2, DNA heteroploid and higher SPF are involved in the progression and heterogeneity of gastric carcinoma.

［KEY WORDS］gastric neoplasms; matrix metalloproteinases； matrix metalloproteinase inhibitor； DNA ploidy

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，有关胃癌发生、演进和转移的机制正在研究之中［1］。基质金属蛋白酶（MMPs）可降解基膜及细胞外基质（ECM）［2］的主要成分，从而促进肿瘤的演进。有研究显示，在许多肿瘤中MMPs表达增加，MMP2及MMP9与肿瘤侵袭转移呈正相关，但也有学者证实MMP9与侵袭转移无关［3］。组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是MMPs的天然抑制剂,其与MMPs结合形成复合物从而调节MMPs的活性。本实验拟采用免疫组化方法，检测MMP9和TIMP2在胃癌、癌周黏膜、转移淋巴结和远处转移灶中的表达，并且结合流式细胞术分析胃癌、癌周黏膜及远处转移灶中DNA倍体及S期分数(SPF)，以便更深入地了解肿瘤演进的分子和细胞学机制。

1 材料和方法

1.1 标本及来源收集青岛大学医学院附属医院病理科2000年4月~2003年9月间存档胃癌手术标本蜡块99例（原发癌91例，复发癌8例）、胃癌远处转移灶16例、癌周正常黏膜16例、胃癌转移淋巴结25例，共计156例，所有病人术前均未经过化疗和放疗。所有标本均经40 g/L中性甲醛固定24~48 h后石蜡包埋。99例胃癌病人中男87例，女12例；年龄32～82岁，中位年龄58.2岁。石蜡标本各切4 μm厚连续切片3张，分别用于免疫组化和苏木精伊红染色。从用于免疫组化检测的石蜡标本中选取47例胃癌、6例癌周黏膜及4例胃癌远处转移灶标本作为流式细胞术研究对象。每一标本均切50 μm厚切片5片，并且在每一样本中各加一片50 μm厚同样固定和包埋的淋巴结作为内标制作单细胞悬液。

1.2 试剂山羊抗人TIMP2多克隆抗体、兔抗人MMP9单克隆抗体为Santa Cruz公司产品；SP免疫组化试剂盒为Zymed公司产品；DNA染色试剂盒为Beckman Coulter France SA公司产品。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色及结果判定 采用SP法，根据试剂盒说明书操作。其中MMP9和TIMP2一抗浓度分别为1∶60和1∶30，阳性对照分别采用直肠癌和乳癌组织，阴性对照采用PBS (0.01 mol/L,pH 7.4)代替一抗。评分由两个独立的观察者进行盲评，TIMP2和MMP9阳性细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着。根据DANIELA等的方法参照染色强度和染色细胞分布进行评分。①阴性（-）：无细胞着色；②阳性（+）：阳性细胞＜20%；③阳性（）：阳性细胞占21%~50%；④阳性（）：阳性细胞＞50%。

1.3.2 流式细胞术检测DNA倍体和SPF 用改良HEDLEY程序，将石蜡切片脱蜡、水化，经5 g/L的胃蛋白酶消化，离心(1 500 r/min)5 min，过滤得单细胞悬液；然后孵育于DNA染色液中30 min后上机（Beckman Coulter，FCM），检测20 000个细胞的DNA倍体和SPF，根据DNA指数判定二倍体或异倍体［4］。

1.4 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件，数据间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 MMP9和TIMP2表达与胃癌病理特征和临床特征的关系MMP9表达与LAUREN分型、BORRMANN分型、淋巴结转移、肿瘤转移、浸润深度肥及肿瘤TNM分期有关，而且在癌与癌周非癌黏膜间其表达的差异有显著意义；TIMP2表达与Borrmann分型、淋巴结转移和浸润深度有关。见表1、2。并且MMP9表达阳性者TIMP2阳性率增高，二者呈正相关关系（r=0.22，P<0.05）。见表3。

表1 MMP9和TIMP2表达与胃癌组织病理特征的关系略

表2 MMP9和TIMP2表达与胃癌临床特征的关系略

2.2 DNA倍体及SPF表达与胃癌病理特征和临床特征的关系DNA异倍体率与肿瘤分化和淋巴结转移有关；SPF与肿瘤大小、分化和淋巴结转移有关；而且癌与癌周非癌黏膜之间DNA异倍体率和SPF的差异具有显著性。见表4。

表3 MMP9和TIMP2相关性（略）

表4 DNA倍体和SPF表达与胃癌组织病理特征和临床特征的关系略

3 讨 论

3.1 MMP9和TIMP2表达与肿瘤演进的关系肿瘤演进是一多步骤、多因素、多环节共同参与的复杂过程，其中基膜和细胞外基质的降解是肿瘤演进的关键步骤。本文研究结果显示，MMP9的表达与肿瘤的恶性程度有关，在肿瘤侵袭前沿或瘤细胞巢周围MMP9显示强阳性表达，而非癌黏膜则显示较弱阳性表达，MMP9水平上调可促进基膜及细胞外基质的降解从而促进肿瘤细胞侵袭与转移。不仅瘤细胞本身分泌MMP9，瘤细胞诱导周围炎细胞分泌更多的MMP9，这种分泌被认为是肿瘤诱导的宿主反应［5］，这种反应与瘤细胞促进的炎症反应［6］互相促进从而形成恶性循环。MMP9的异常表达贯穿胃癌发生和演进的整个过程，即使是黏膜内胃癌，癌细胞已存在异常的MMP9分泌。本文研究结果显示，随着浸润深度的增加，MMP9的免疫反应性增加，从而促进肿瘤局部侵袭；而且在淋巴结转移阳性病例中，其表达率明显高于阴性病例，这提示其对肿瘤转移发挥着重要作用。本文结果显示，在癌与癌周黏膜之间MMP9的表达有很大差异，阳性率分别为66.7%和31.3%。这更一步说明MMP9参与肿瘤发生和演进。最近研究认为，MMPs在肿瘤转移过程中不仅具有降解基膜的作用，而且还可以保持细胞外基质中生长因子活性从而调节血管发生［7］。肿瘤组织分泌高水平MMP9，并不一定说明肿瘤一定发生局部侵袭和远处转移，因为有MMP9抑制因子的抑制作用。TIMPs是MMPs内源性特异抑制因子，可通过抑制MMP家族成员细胞降解基膜及细胞外基质的作用从而发挥抗肿瘤转移功能。有关胃癌的研究显示，TIMP2在肿瘤中的表达率为57%，而在正常黏膜中为阴性［8］。而本研究结果显示，TIMP2在正常黏膜中为阳性表达，与肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关，并且与MMP9的表达存在正相关关系；虽然TIMP2的表达水平随着MMP9水平增高而增高，但二者水平处于失衡状态，结果导致肿瘤的局部侵袭和远处转移，提示MMP9/TIMP2的失衡在肿瘤演进过程中发挥着更重要的作用。

3.2 DNA倍体分析的意义正常的人类细胞为整倍体细胞，且处于S期的细胞仅占少数，但肿瘤组织常发生染色体突变，结果导致非整倍体或异倍体细胞的出现和S期细胞比例的增高。国内外研究证明，如果DNA含量发生微小的异常变化，就有可能导致恶性肿瘤。因此，测量和分析细胞的DNA含量和倍体对恶性肿瘤的诊断具有