【摘要】 目的 探讨cyclinD2、p27kipl的表达与胃癌发生发展的关系。方法 用免疫组化方法检测cyclinD2和p27kipl在120例胃癌、20例胃粘膜非典型增生、30例正常胃粘膜中的表达。结果 cyclinD2在正常胃粘膜、非典型增生、胃癌中阳性表达率分别是3.3%、10%、和34.2%，胃癌与正常胃粘膜及非典型增生相比有显著性差异（P<0.01）,p27kipl在正常胃粘膜、非典型增生、胃癌中表达分别是100%、90%、和52.5%。胃癌与其他两组比较有显著性差异（P<0.01），p27kipl表达缺失和cyclinD2胞浆阳性者与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关（P<0.01）。cyclinD2和p27kipl表达呈负相关。结论 cyclinD2和p27kipl与胃癌的发生有密切关系，p27kipl的表达缺失及cyclinD2胞浆阳性者与胃癌的进展有关，p27kipl可作为估计预后的重要指标。

【关键词】 细胞周期素D2 p27kipl 胃肿瘤 免疫组织化学

0 引言

细胞周期的调控失常导致细胞的异常增殖，是肿瘤发生的关键环节。尤其是G1期细胞的调控尤为重要。目前的研究表明细胞周期素D和E（cyclinDs和cyclinE）和细胞周期素依赖性激酶（CDKs）复合物在G1期细胞周期转化中起重要作用，其过度表达和肿瘤关系密切［1,2］。p27kipl是一种非特异性细胞周期抑制蛋白，为细胞周期的负调控因子。关于cyclinD1、cyclinE、CDKs等在肿瘤中的研究已有不少报道，但有关cyclinD2的研究则很少。本文应用免疫组化方法检测cyclinD2和p27kipl在胃癌中的表达，探讨其在胃癌发生、发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 选取1993～2000年我室存档的胃癌病理标本170例，其中正常胃粘膜30例，胃粘膜不典型增生20例，均为胃镜活检标本，胃癌根治术标本120例，其中82例进行了局部淋巴结清扫。120例中男92例，女28例，平均年龄56.9岁（34～71岁）。全部病例根据WHO食管和胃肿瘤组织学分型（1990）标准进行病理组织学诊断和组织学分级，按胃癌的分化程度分为高分化腺癌（45例）、中分化腺癌（39例）、低分化腺癌（36例），未分化癌（0例）。淋巴结转移情况：局部淋巴结转移48例，无转移72例。

1.2 方法 所有标本常规取材，福尔马林固定，石蜡切片（4μm），用于免疫组化染色。采用SP法，玻片经多聚赖氨酸预处理，微波抗原修复。一抗采用鼠抗人cyclinD2，鼠抗人p27kipl单克隆抗体。一抗和SP试剂盒购自福州迈新公司。染色过程按试剂盒说明操作。

1.3 结果判定 切片免疫组化染色分析以已知阳性的乳腺癌为阳性对照，以PBS替代一抗为阴性对照。p27kipl阳性反应定位于细胞核和/或细胞浆，显微镜下随机选择10个高倍视野计数，阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性［3］。cyclinD2阳性反应定位于细胞核和/或细胞浆，以细胞核着色为主判为细胞核阳性，以细胞浆着色为主判为细胞浆阳性，阳性判定标准以≥10%为界值［4］。

1.4 统计分析 使用χ2检验和U检验。cyclinD2和p27kipl阳性表达的关系经相关系数计算并进行显著性检验。

2 结果

2.1 cyclinD2和p27kipl在正常胃粘膜、非典型增生和胃癌中的表达 在120例胃癌中cyclinD2阳性为41例、占34.17%。正常胃粘膜和非典型增生分别为1例（3.33%）和2例（10%），两组相比较，无显著性差异（P>0.05）,胃癌与正常胃粘膜和非典型增生相比较，有显著性差异（P<0.01）。p27kipl在正常胃粘膜中的表达为100%，在非典型增生中为90%，两者比较无显著性差异（P>0.05），而p27kipl在胃癌中的阳性表达为63例，占52.5%，与正常胃粘膜、非典型增生比较均有显著性差异（P<0.01）。在阳性物质表达上，cyclinD2定位于细胞核者14例，占阳性细胞34.15%（图1），定位于胞浆者有27例，占65.85%（图2，3）。p27kipl阳性表达以细胞核为主（图4），部分病例胞浆中也有阳性物质分布（图5）。

2.2 cyclinD2和p27kipl阳性表达与胃癌临床病理特征的关系，见表1。3组不同分化程度及两组不同浸润程度的胃癌中cyclinD2的表达无显著性差异（P＞0.05），但在伴局部淋巴结转移的病例中阳性表达率明显高于无淋巴结转移者（P<0.01）。p27kipl表达率和胃癌的分化程度、浸润范围以及有无局部淋巴结转移均有密切关系（P<0.01）。显示随胃癌分化程度降低和侵袭性增强，p27kipl蛋白表达缺失愈加明显。

对胃癌中cyclinD2和p27kipl表达进行相关分析,发现这两种细胞周期调节因子的表达在胃癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移方面呈显著负相关（P<0.01）。

表1 胃癌cyclinD2和p27kipl的表达与临床病理参数的关系（略）

a: P>0.05，b:P>0.05，c:P<0.01，d:P<0.01，e: P<0.01，f: P<0.01

2.3 胃癌cyclinD2阳性物质定位与临床病理的关系 表2显示cyclinD2阳性物质定位和胃癌临床病理参数的关系，提示cyclinD2胞浆着色倾向于分化较差的（cyclinD2阳性的11例低分化癌中，胞浆型占10例），癌浸润较深（P<0.05）（图6），较易发生淋巴结转移（P<0.01）。cyclinD2细胞核阳性者与此相反。

表2 cyclinD2阳性表达类型与胃癌临床病理的关系（略）

a:P>0.05；b:P<0.05；c:P<0.01；d:P<0.05；e:P>0.05

低分化癌中，cyclinD2定位于胞浆与定位于胞核相比较P<0.01。

3 讨论

最近的研究认为细胞周期调控的异常与肿瘤发生关系密切，细胞周期的转化受细胞周期素（cyclins）和细胞周期素依赖性激酶（CDKs）的调节，G1期细胞周期素包括cyclin D1、D2、D3和cyclin E。在G1期细胞，cyclin D与CDK4，cyclin E和CDK2结合形成cyclinsCDKs复合物对哺乳动物G1期细胞发挥催化作用并调节G1/S期的转化。此前，人们对cyclin D1和cyclin E在各种肿瘤中的研究已表明，cyclinD1的过度表达与多种肿瘤的演进和不良预后有关，而成为一种原癌基因［5］ ，对于cyclin E的表达多数报道认为与肿瘤细胞的异常增殖有关，但也有研究持不同观点［6］。cyclinD2和 cyclinD1均为G1期细胞调节因子，对其和肿瘤的关系研究很少。本文免疫组化染色结果提示cyclinD2在非典型增生中的表达高于正常胃粘膜，但差异不显著，说明cyclinD2这种原癌基因在非典型增生阶段尚未完全表达。而在胃癌组织中cyclinD2的阳性表达率为34.2%，明显高于正常胃粘膜和非典型增生，而且差异有显著性。此结果首先从蛋白质水平证实了cyclinD2是一种原癌基因，其表达可能导致癌变；其次也说明胃癌和癌前病变是截然不同的两个阶段。考虑到本组资料非典型增生病例数目较少，其意义尚待进一步研究。国外文献报道cyclinD2阳性表达可能与癌的演进有关［7,8］，本文通过对临床病理资料初步分析显示cyclinD2表达和胃癌分化程度、浸润范围之间的关系无统计学意义，但易发生淋巴结转移。进一步的研究发现cyclinD2表达的意义可能和其阳性物质的定位有关。本组资料cyclinD2阳性的41例胃癌中，有14例阳性物质定位于胃癌细胞的细胞核（34.15%），而27例则定位于胞浆（65.85%）。定位于细胞核者倾向于分化程度高、浸润较浅，而定位于细胞浆则倾向于癌组织分化较差、浸润性强和更易发生淋巴结转移。因而提示，cyclinD2在细胞浆出现表达产物可能在肿瘤的演进方面发挥重要生物学作用，从而导致不良预后，而定位于细胞核则可能相反。在此cyclinD2表达的意义与cyclinD1显然有所区别，当然，其确切的作用机制尚需进一步研究。

人类p27基因定位于12q13，它的表达产物p27kipl蛋白由Polyak等人于1994年发现，分子质量为27×103，是细胞周期G1期的负调控因子［9］，它主要是与cyclinD2/CDK4或cyclinE/CDK2复合物结合，抑制其活性从而抑制G1/S期的转化和细胞的增殖，多数学者认为p27kipl在肿瘤中的改变主要是蛋白表达的异常，可能是转录水平降低或蛋白降解活性提高造成的［10］。本文研究结果表明，p27kipl在正常胃粘膜上皮高表达，而在癌组织内的表达水平显著降低，有随癌组织分化程度降低而降低的趋势。本项研究还发现p27kipl阳性表达的病例，瘤细胞浸润性较差，淋巴结转移率低，表明p27kipl在胃癌的进展过程中逐渐丧失了抑癌作用，使癌细胞具有更高的恶性程度和侵袭力。说明p27kipl表达缺失影响肿瘤细胞的分化，并进而和肿瘤的演进有关。这些结果与此前人们对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌的研究结果一致［1012］。并认为p27kipl的低水平表达是预后不良的一种指标［12］。

本文对cyclinD2和p27kipl在胃癌中的表达进行了相关分析，发现两者在胃癌分化程度、浸润范围及局部淋巴结转移方面呈显著负相关。认为作为细胞周期的重要调控因子，两者在和CDKs结合后分别发挥了激活和抑制作用，从而影响细胞周期的转化，影响细胞的分化，在促进或抑制细胞的增殖方面均有重要作用，其确切的关系尚需更深入的探讨。

综上所述，cyclinD2和p27kipl的异常表达与胃癌的发生有密切关系，p27kipl的低表达及cyclinD2胞浆阳性与胃癌的进展有密切关系，并可作为估计胃癌预后的一个重要指标。

(本文图见封2)（略）

【参考文献】
［1］ Gansauge S, Gansauge F, Ramadani M, et al. Overexpression of Cyclin D1 in human pancreatic c