【摘要】 探讨Ｆａｓ／ＦａｓＬ基因蛋白在胃癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组化、特定组织蛋白提取及Ｗｅｓｔｅｍ印迹杂交技术，对２０例正常胃黏膜，２２例癌前病变和３５例胃癌组织中Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达情况加以分析。结果：正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织的Ｆａｓ阳性率分别为８5％、４5％、３7％；ＦａｓＬ的阳性率分别为20％、２7％、４6％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交显示：胃癌细胞产生的Ｆａｓ蛋白以分子量３０ｋＤａ的可溶型Ｆａｓ（ｓＦａｓ）为主，伴少量的４３ｋＤａ膜型Ｆａｓ（ｍＦａｓ）。结论：Ｆａｓ在正常胃黏膜和癌前病变、胃癌组织中的表达强度差异有显著性（Ｐ＜００５）；ＦａｓＬ在胃癌组织和正常胃黏膜、癌前病变中的表达强度差异有显著性（Ｐ＜００５）。

【关键词】 胃癌Ｆａｓ／ＦａｓＬ 基因表达 免疫逃逸 细胞凋亡

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｏｌｕｂｌｅＦａｓ／ＦａｓＬｉｎＨｕｍａｎＧａｓｔｒｉｃＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＩｔｓＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ

ＧＡＮＧＹａｎ，ＬＩＵＮｉｎｇ，ＷＡＮＧＹａｌｕｎ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｃｍｉｓｔｅｒｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００３４，Ｃｈｉｎａ）

ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｒｏｌｅｏｆＦａｓ，ＦａｓＬｉｎｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦａｓａｎｄＦａｓＬｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＷｅｓｔｅｍｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｓｏｆＦａｓｉｎｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｗｅｒｅ８5％，４5％ａｎｄ３7％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｓｏｆＦａｓＬｉｎｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｗｅｒｅ20％，２7％ａｎｄ４6％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＷｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ：ｔｈｅＭＷｏｆＦａｓｉｓ３０ｋＤａ，ａｎｄｔｈｅｓｔｙｌｅｏｆＦａｓｉｓｓｏｌｕｂｌｅＦａｓ（ｓＦａｓ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆａｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ（Ｐ＜００５）．ＦａｓＬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓａｎｄｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓ（Ｐ＜００５）．

ＫｅｙｗｏｒｄｓｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａＦａｓ／ＦａｓＬ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｅｓｃａｐｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 胃癌是发病率较高的恶性肿瘤之一，发病机制尚不十分清楚。Ｆａｓ（ＣＤ９５／ＡＰＯ１）是肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一神经生长因子（ＮＧＦ）受体超家族成员，它通过与其配件（Ｆａｓｌｉｇａｎｄ，ＦａｓＬ）相互作用，调控细胞的生存和凋亡［１］。研究表明：Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统的异常表达，不仅参与胃癌过程中细胞凋亡异常的调节，而且与胃上皮细胞癌变及免疫逃逸有关［２］。本文通过检测正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织ＦａｓＦａｓＬ的表达，探讨其在胃癌发生、发展中的作用。

１ 材料和方法

１１ 组织来源 ２０例正常胃黏膜、２２例癌前病变和３５例胃癌组织（人正常胃黏膜和胃癌手术切除）标本选自本室与中国医科大学附属第一医院肿瘤外科共建瘤库。标本在术后２ｈ内获取，液氮速冻后，－７０℃保存。

１２ 主要试剂 兔抗人Ｆａｓ、ＦａｓＬ抗体（ＳａｎｔＣｒｕｚ，ＵＳＡ）购自北京中山生物技术公司；增强化学荧光蛋白检测（ＥＣＬ）试剂盒系英国Ａｍｅｓｈａｍｅ公司产品；ＡＢＣ试剂盒为美国Ｖｅｃｔｏｒ公司产品。

１３ 方法

１３１ 冰冻组织切片 将冰冻切片机（Ｌｅｉｃａ１８００型）的操作箱用１００％乙醇擦洗数次，以灭活蛋白酶；温度降至－２０℃左右，然后按常规方法做以上组织的冰冻切片。

１３２ 免疫组织化学染色 将上述切片做ＨＥ染色，组织病理学观察，选择病变典型的切片用冷丙酮固定，－２０℃保存，用于免疫组织化学染色。抗Ｆａｓ－ＦａｓＬ抗体的工作浓度均为１∶１００。以食道鳞状上皮为阳性对照。ＡＢＣ免疫组织化学染色的步骤按文献［３］所述方法进行。

１３３ 特定组织的蛋白提取 冰冻组织的连续切片，ＨＥ染色，组织病理学观察。若有多种组织存在，则按本研究室建立的特定组织选择法［４］进行蛋白提取。选择切片总体积约２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ，立即用加样器吸头将其移至含５０μｌ １２×ｌａｅｍｍｌｉＳＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ，超声破碎，加热５ｍｉｎ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清，用紫外分光光度计进行蛋白浓度然后调整浓度至４ｇ／Ｌ，－７０℃保存备用。

１３４ 蛋白分析 取１００μｇ蛋白样本，在１０％ＳＤＳＰＡＧＥ中电泳分离，蛋白按常规行电转移，恒流８０ｍＡ，过夜。固相支持物为硝酸纤维素膜。５％脱脂奶粉（ＤＩＦＣＯｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ），０５％Ｔｗｅｅｎ２０封闭４５ｍｉｎ，以稀释度为１∶５００的Ｆａｓ、ＦａｓＬ抗体与膜上靶蛋白孵育４５ｍｉｎ。辣根过氧化物酶偶联的猪抗兔抗体（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）作用后，用ＥＣＬ荧光显色系统曝光显色。

１３５ 统计学分析 数据进行χ２检验。

２ 结果

免疫组织化学染色的结果显示：Ｆａｓ在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织的阳性率分别为８5％、４5％、３7％，Ｆａｓ在正常胃黏膜的表达显著高于癌前病变和胃癌组织（Ｐ＜００５）；ＦａｓＬ在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织阳性率分别为20％、２7％、４6％，ＦａｓＬ在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜和癌前病变（Ｐ＜００５）。Ｆａｓ的表达部位基本以细胞为主，表现为细胞浆呈棕黄色染色颗粒。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交显示：胃癌细胞产生的Ｆａｓ蛋白以分子量３０ｋＤａ的可溶型Ｆａｓ（ｓＦａｓ）为主，伴少量的４３ｋＤａ模型Ｆａｓ（ｍＦａｓ），见表1。表1 Fas和Fasl在不同组织中的表达情况

３ 讨论

恶性肿瘤的发生发展是一个多阶段的过程，一般表现为正常上皮、不典型增生、原位癌、浸润癌，同时肿瘤的发生是多基因变异积累的过程。近年研究发现，细胞凋亡的抑制在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。由Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统及其细胞内信号传导分子构成了细胞凋亡的重要通路，在此通路上任一环节的缺失都可导致癌细胞逃逸细胞凋亡，从而实现无限增殖［５］。本组实验结果表明：癌前病变、胃癌组织细胞Ｆａｓ阳性表达率显著低于正常胃黏膜，提示胃癌细胞Ｆａｓ下调；癌前病变、胃癌组织细胞ＦａｓＬ阳性表达率显著高于正常胃黏膜，提示胃癌细胞ＦａｓＬ上调。因此证实了胃癌组织细胞中存在Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统平衡失调，导致Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统介导的细胞凋亡途径发生异常，可能是胃黏膜癌变过程中细胞凋亡抑制的重要机制之一［６］。另外，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交显示：胃癌细胞产生的Ｆａｓ蛋白以分子量３０ｋＤａ的可溶型Ｆａｓ（ｓＦａｓ）为主，伴少量的４３ｋＤａ膜型Ｆａｓ（ｍＦａｓ）。胃癌细胞中缺乏膜型Ｆａｓ的表达