【摘要】 目的 探讨胃癌微淋巴管的分布特点以及增殖状态。方法 应用双重免疫组织化学染色的方法，采用Podoplanin及 Ki67标记56例胃癌及12例相应正常胃组织，并检测微淋巴管及微淋巴管内皮细胞的增殖活性。结果 正常胃组织微淋巴管在黏膜固有层、黏膜下层、肌层及浆膜层均可见到，且在黏膜下层数目最多，多呈扩张状，壁薄，形态大小不一，其微淋巴管密度（LMVD）为6.93±1.32。胃癌微淋巴管在癌周及癌内数目及形态均不同，癌内微淋巴管数目少，其LMVD为5.83±3.26，并且多闭锁呈条索状；癌周微淋巴管数目多，其LMVD为11.89±3.95，且扩张呈管腔样，有时可在其中发现癌栓。癌周LMVD与癌内比较，差别有高度统计学意义(t=10.1，P<0.01)；与相应正常胃组织比较,差别亦有统计学意义(t′=7.52，P<0.05)。胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数与癌内微淋巴管及相应正常胃组织微淋巴管相比较，差别均有统计学意义(t=6.38、6.88，P<0.05)。结论 胃癌组织中存在新生微淋巴管，癌周数目较多，且具有较高增殖活性，提示癌周微淋巴管可能是发生淋巴结转移的主要功能性淋巴管。

【关键词】 胃肿瘤 微淋巴管密度 淋巴管生成

OBSERVATION OF DISTRIBUTION FEATURES AND PROLIFERATION OF LYMPHATIC VESSELS IN GASTRIC CANCERXU JING, XIANG FENGGANG, WANG NING(Lab of Human Micromorphology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the distribution pattern and proliferation of lymphatic vessels in gastric cancer.MethodsUsing monoclonal antibody against podoplanin, lymphatic vessel density (LMVD) in tissues of 56 cases of gastric cancer and of 12 cases of normal stomach was studied. Lymphatic endothelium was displayed by double immunohistochemicallabeling using Ki67.ResultsLymphatic vessels were easily found in the whole wall of normal stomach with LMVD 6.93±1.32, while lymphatic vessels in cancerous tissues were fewer (LMVD 5.83±3.26) with narrower lumens, lymphatic vessels in pericancerous tissues more than those of normal tissues (LMVD 11.89±3.95) with dilated lumens. The differences in LMVDs among different tissue samples were significant （P<0.01）. The Ki67 labeling index of the lymphatic endothelium was found significantly higher in pericancerous tissues than that of normal gastric submucosa and in cancerous tissues (t=6.38,6.88;P<0.05).ConclusionIn pericancerous tissues, newly formed lymphatic vessels may play an important role in lymphatic metastasis.

［KEY WORDS］stomach neoplasms; lymphatic vessel density; lymphangiogenesis

淋巴道转移是胃癌最常见和最重要的转移途径，也是影响病人生存的重要因素之一。然而长期以来，由于缺乏淋巴管特异性标记物，对肿瘤淋巴管生成、分布及其增殖状态的研究一直较为薄弱。肿瘤内是否存在新生淋巴管？肿瘤细胞是通过原有淋巴管还是通过新生的淋巴管进行转移？这些问题一直存在争议。胃癌局部淋巴结转移十分常见，但其淋巴管的生成、分布及增殖状态目前仍不清楚。为此，我们采用新近发现的淋巴管特异性标记物Podoplanin来标记胃癌组织的微淋巴管，同时用Ki67显示微淋巴管内皮细胞的增殖状态，即通过免疫组织化学双重标记法，在切片上同时显示微淋巴管及处于增殖状态的微淋巴管内皮细胞，从而探讨胃癌微淋巴管的生成、分布特点及其增殖状态。

1 材料与方法

1.1 材料

选取青岛大学医学院附属医院病理科2005年1～12月手术切除的胃癌存档蜡块56例及其正常胃组织蜡块12例，每1例胃癌蜡块均包含取自于癌中央区（即癌内）及癌组织和周围正常组织交界区（即癌周）的组织。病人手术前未接受过化疗和放疗。病人中男31例，女25例；平均年龄58岁（42～75岁）。高分化腺癌8例，中分化腺癌20例，低分化腺癌28例。分期采用1987年国际抗癌联盟 （UICC）PTNM分期标准,其中Ⅰ期＋Ⅱ期35例,Ⅲ期＋Ⅳ期21例。根据肿瘤浸润深度，侵犯至黏膜及黏膜下层者6例，侵犯至肌层者18例，侵犯至浆膜及浆膜外者32例。根据病情进展情况，早期胃癌6例，中晚期胃癌50例。伴有淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者29例。所有蜡块均行连续石蜡切片，厚度为5 μm，行免疫组织化学双重染色。

1.2 免疫组织化学双重染色

一抗分别为淋巴管内皮细胞特异性标记物Podoplanin和检测细胞增殖状态的抗体ki67，分别购自Angiobio公司和北京中杉试剂公司。HistastainTMDS双染试剂盒购自Zymed公司。染色步骤如下：切片脱蜡，梯度乙醇水化，使用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,微波修复抗原，血清封闭，加一抗（Podoplanin，工作浓度为1∶200），加生物素化二抗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，用DAB显色，显微镜下监控，蒸馏水终止反应。加双染增强剂，再次微波修复抗原，血清封闭，加第二种一抗（Ki67，工作浓度为1∶100），加生物素化二抗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，用AEC显色，显微镜下监控，自来水终止反应，苏木精复染，使用水溶性封片剂封片。以结肠癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 观察指标

分别测定相应正常胃组织、胃癌癌内、癌周组织微淋巴管密度（LMVD）及微淋巴管内皮细胞Ki67指数。

1.4 结果判定

以Podoplanin染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为一个阳性微淋巴管。参照WEIDNER[1]报道方法进行LMVD计数。在低倍镜下先选取胃癌癌周、癌内，以及相应正常胃组织阳性染色微淋巴管最密集区即“热点”，然后在200倍视野下计数LMVD，每例计数3个视野，取均值。微淋巴管被染为棕黄色，而具有增殖活性的微淋巴管内皮细胞核及胃癌细胞核呈鲜红色。参考WULFF等[2]的方法，计算微淋巴管内皮细胞Ki67指数。

1.5 统计学处理

实验数据均以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行两样本均数t检验、配对t检验。

2 结 果

2.1 胃癌及相应正常胃组织中微淋巴管的形态及分布特点

正常胃组织Podoplanin阳性染色微淋巴管在黏膜固有层、黏膜下层、肌层及浆膜层均可见到，在黏膜下层数目最多，且多呈扩张状，壁薄，形态大小不一。其LMVD为6.93±1.32。胃癌组织中也可见到明确的Podoplanin阳性染色微淋巴管。微淋巴管内未见红细胞，少数微淋巴管内可见淋巴细胞。有淋巴结转移的胃癌切片中可在微淋巴管内发现癌栓，甚至在1例苏木精伊红染色未发现淋巴结转移的胃癌微淋巴管内也发现癌栓。在胃癌组织中，癌周及癌内均有微淋巴管分布，但其数目及形态有明显的异质性，癌周微淋巴管数目多且管腔多扩张，其LMVD为11.89±3.95；而癌内微淋巴管数目少，多为闭锁的条索状，或呈狭长的裂隙状，其LMVD为5.83±3.26，癌周与癌内LMVD比较，差异有高度统计学意义(t=10.1，P<0.01)，癌周与相应正常胃组织LMVD 比较，差异亦有统计学意义(t′=7.52，P<0.05)。

2.2 胃癌及相应正常胃组织微淋巴管内皮细胞增殖活性

Podoplanin和Ki67双标染色显示，胃癌微淋巴管内皮细胞核呈不同程度的Ki67表达，而相应正常胃组织微淋巴管内皮细胞无Ki67表达。癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数（0.04±0.02）分别与癌内（0）及相应正常胃组织（0）比较，差异有统计学意义(t＝6.38、6.88,P<0.05)。

3 讨 论

许多研究已经证实血管形成对肿瘤的发生发展和转移十分重要，但是到目前为止，淋巴管形成在肿瘤转移中的研究较少，其原因是缺乏淋巴管特异性标记物。Podoplanin是一种相对分子质量为4.3万的肾小球足细胞的膜黏蛋白，参与足细胞足突的形成和塑形。先前认为它只表达于小淋巴管内皮，目前研究显示皮肤某些血管内皮细胞也可以表达Podoplanin，但是其他器官和组织的血管内皮没有发现其表达。因此，认为该蛋白是目前较为理想的淋巴管标志物[3]。对于淋巴系统而言，Podoplanin只染小的、由单层内皮衬托的微淋巴管，而有外周细胞或平滑肌细胞的大淋巴管，以及淋巴结的高内皮小静脉均不染色。超微结构显示，Podoplanin主要表达在淋巴管内皮细胞的腔面，很少表达于对腔面和细胞间隙[4]。本研究显示，Podoplanin标记的微淋 巴管中均未见红细胞，肿瘤细胞也无免疫染色，这说明Podoplanin可特异性标记微淋巴管，是研究肿瘤微淋巴管的特异性标记物。

3.1 胃癌微淋巴管的生成特点及分布特点

有研究结果表明，肿瘤内微淋巴管可能并非为肿瘤刺激新生，而是由原来存在于间质中的微淋巴管，在肿瘤细胞增殖引起间质水肿、压力升高的情况下，被动扩张而形成的[5]。近年来，随着VEGFC和VEGFD的克隆成功及淋巴管内皮细胞特异性标记物<