【关键词】 胃癌 CK20 mRNA CD44v6 RT PCR

许多恶性肿瘤的重要转移途径是血行转移，也是根治手术失败的主要原因，细胞角蛋白20(CK20)具有严格的上皮特异性，在正常血液、淋巴液中表达阴性，但在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移等改变时持续表达阳性。因此检测血中CK20 mRNA，就可证明血中存在游离在循环血中的癌细胞(Circulating tumors cell，CTC)。有关CK20 mRNA检测用于判定血中是否存在CTC，以及CD44v6在肿瘤组织中检测方面，国内外已有过一些报道，但就CTC在血中的出现与CD44v6表达关系方面，目前国内外尚未见报道。本文旨在探讨CTC的出现与CD44v6表达之间的关系。

1 对象与方法

11 对象 胃癌组40例，男32例，女8例，年龄59～63例。病理类型：均为进展期胃癌，其中结节型18例，溃疡型14例，溃疡浸润型8例。术式：为标准R2～R3。良性对照组20例，男14例，女6例，平均年龄55～59岁，其中胃溃疡8例，十二指肠溃疡12例，术式为标准胃大部分切除术(BillrothⅡ式)。

12 方法 RTPCR法检测CK20 mRNA

121 所有病人在术前3 d采周围静脉血5～10 ml，术后当日采周围静脉血5～10 ml，常规肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离，加入Trizol 1 ml置-20℃保存。

122 总RNA提取 标本血的单个核细胞中加入1 ml Trizol，室温下放置5 min，加入02 ml氯仿，室温下振荡15 min，放置23 min，于28℃下12 000 r/min离心15 min。吸取上层无色液相至另一管中，加入05 ml异丙醇，室温下放置10 min，于28℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1 ml，振荡器混匀，28℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，半干时用无RNase水溶解，吸头冲吸混匀，置55℃～60℃ 10 min使其充分溶解，在分光光度计上检测A260／A280的比值，以验证RNA的纯度。RNA定量：〔RNA〕μg／ml=A260×44×稀释倍数。

123 RTPCR方法 采用两步法，CK20引物序列上游：5CAGACACACGGTGAACTATGG3，下游：5GATCAGCTTCCACTGTrAGACG3，扩增产物片段长度为370 bp；βaction引物序列上游：5CACTGTGTTGGCGTACAGGT3，下游：5TCATCACCATTGGCAATGAG3，扩增产物片段长度为154 bp。引物均由加拿大Sangon上海分公司合成，PAGE纯化。RT的反应体积为20 μl。逆转录反应体系如下：10×逆转录缓冲液2 μl，10 mmol／L dNTPs 2 μl，RNase 05 μl，AMV逆转录酶1 μl，25 mmol／L MgCl2 4 μl，Oligo 1 μl，样本RNA 3 μl，补DEPC处理过的水至体积20 μl。上述成分混合后置于PE2400型PCR仪中，42℃30 min，99℃ 5 min灭活AMV酶。PCR反应体系：逆转录产物10 μl，TaqDNA酶1 μl，引物20 pmol，补DEPC处理过的水至终体积100 μl。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物15 μl上样于2%琼脂糖凝胶(05 μg／ml溴化乙锭)，5 V／cm电泳，电泳脉冲液为1×TBE，紫外透析灯下对凝胶进行摄影，有特异性橙红色条带者为阳性。

13 SABC免疫组化法检测CD44v6 组织石腊切片置二甲苯及酒精中脱腊。将切片置05%H2O2甲醛中20 min去除内源酶。10%BSA封闭。加一抗100 μl覆盖切片，加二抗100 μl覆盖切片，加三抗100 μl覆盖切片。加配制好底物100 ml作用5 min。1%甲基绿复染，二甲苯透明树胶封片。置Olympus显微镜下观察。检测组织的细胞膜及细胞质内出现棕褐色反应者为阳性反应，无着色者为阴性反应。

14 统计学分析 采用χ2检验。

2 结果

表1显示：胃、十二指肠良性疾病组病人手术前后CK20 mRNA表达均为阴性。胃癌组术后阳性率375%明显高于术前225%，二者比较差异显著(P＜005)。CD44v6在术后切下肿瘤标本中表达情况：CK20 mRNA表达阳性组中阳性率为733%、在CK20 mRNA表达阴性组中阳性率为32%，二者比较差异非常显著(P＜001)，见表2。

表1 胃癌患者手术前后外周血CK20 mRNA检测结果（略）

与术前相比较：1)P＜005

表2 CD44v6在各组病人中的表达情况（略）

与阴性组相比较：1)P＜001

3 讨论

影响胃癌病人预后的因素除了诊断，手术的时间外，就是术后复发、转移等问题。胃癌的复发和转移主要是通过血液及淋巴系统播散，癌细胞从原发部位自发或因诊疗操作侵入血管及淋巴管，从而进入外周血循环，并在循环中播散及存活，这种循环中的CTC可落户到其他部位或器官中继续生长，形成转移灶〔1〕。因此早期检测CTC对判断肿瘤预后，选择合理的下一步治疗方案具有重要意义，细胞角蛋白是细胞骨架的组分之一，仅在上皮来源的组织细胞中表达，其中CK20的上皮细胞特异性更为严格，在血、淋巴液及骨髓中均表达为阴性，因此CK20 mRNA可作为检测外周血循环中上来源的癌细胞标记物〔1〕。

本研究结果显示：CK20 mRNA在胃、十二指肠良性疾病组中均表达为阴性，在胃癌组术后阳性率(375%)明显高于术前(225%)，究其原因我们认为：手术中对肿瘤的牵拉、挤压可能促使原发灶癌细胞脱落，通过血管和淋巴管进入体循环。根治术清扫淋巴结时，有癌细胞转移的淋巴结破碎，癌细胞可能经破损组织断面进入血循环。故提醒手术医师要改进无瘤操作技术，术中尽量减少对瘤体的挤压，清除各组淋巴结时，尽量保持每一枚淋巴结的完整性，破损组织断面要尽量缝扎完好，术毕时用5Fu冲洗腹腔，就有可能防止癌细胞播散入血〔3〕。

细胞与细胞之间，细胞与细胞外间质之间黏附特性的异常是恶性肿瘤细胞最基本的生物学特性之一，这种黏附特性的异常导致肿瘤细胞具有了从原发部位脱落并向周围正常组织侵袭的能力，而正是这种侵袭能力的大小决定了决定了肿瘤恶性程度的高低。CD44是一种细胞表面黏附分子，为一种跨膜糖蛋白，是透明质酸等物质的受体，它能介导细胞与细胞、细胞与间质相互接触和结合的过程，在细胞恶性转化过程中其结构和功能均发生显著变化，从而影响转化后肿瘤细胞侵袭转移行为〔4〕。CD44拼接变异体CD44v6可明显改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭与转移能力增强，因此检测胃癌组织中CD44v6的表达，对探讨癌细胞转移的分子机制、胃癌的临床病理生物学行为，以及评价胃癌病人预后均具有重要的临床意义〔5〕。本研究结果显示：血中CK20 mRNA表达阳性组CD44v6表达阳性率为733%，明显高于CK20 mRNA表达阴性组32%(P＜001)，说明血中CTC的出现与CD44v6表达有明显相关性。CD44v6表达率越高，就越容易出现血行转移，更进一步证实了CD44v6参与了肿瘤侵袭转移过程，它可使肿瘤细胞易于从原发灶脱落，经血管或淋巴管进入外周血中。因此我们认为，CD44v6的检测在预测胃癌的转移潜能方面具有较大的实用价值，与胃癌患者的预后密切相关。

【参考文献】
1 Tsavellas G，Huang ACirculating tumor cell clusters in the peripheral blood of colorectal cancer patients〔J〕Clin Cancer Res，2002;8(6)：201521

2 Gradilone A，Gazzaninga P,Silvestri IDetection of CK19、CK20 and EGFR mRNA in peripheral blood of carcinoma patients：correlation with clinical stage of disease〔J〕Oncol Res,2003;10(1)：21722

3 Sadahiro S，Suzuki T,Tokunaga N，et alDetection of tumor cell in the portal and peripheral blood of patients with clorectal carcinoma using competitive transcriptaseploymerase chain reaction〔J〕Cancer,2001；92：125161

4 Matsumura Y，Tarin DSignifcance of CD44 gene products for cancer diagnosis and distase evaluation〔J〕Lancet，1992;340：10538

5 Ham HJ，HO LI，Chang JY，et alDifferential expression of human metastasis adhesion molecule CD44v in nomal and carcinomatous stomach mucosa of chinese subject〔J〕Cancer,1995；75：106571