【摘要】 目的： 研究ezrin基因与胃癌发生发展的关系. 方法： 采用原位杂交和免疫组化法,检测60例胃癌和15例正常及40例不典型增生胃黏膜中ezrin mRNA及蛋白的表达. 结果： 在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中ezrin mRNA及蛋白阳性表达率呈递减趋势. 组间差异性均有统计学意义(P<0.001); ezrin mRNA和蛋白表达在不同浸润深度、肿瘤大小和有无淋巴结转移组内表达率的差异性有统计学意义(P<0.05), 而在年龄、性别和脉管侵犯组内差异无统计学意义(P>0.05). Ezrin mRNA和蛋白表达呈正相关(rs=0.990, P<0.01). 结论： Ezrin表达降低与胃癌的发生、发展及浸润转移有密切关系.

【关键词】 胃肿瘤；ezrin基因；原位杂交；免疫组织化学

Implications of ezrin expression in gastric carcinoma

ZHANG JunHui, LIU Bin, XING ChuanPing, GAO ZiFang, DONG Liang, HA YingDi, QIAN Zhen

Department of Pathology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China

【Abstract】 AIM: To study the relationship between ezrin gene and the generation and development of gastric carcinoma. METHODS: The expressions of ezrin mRNA and protein were respectively detected by immunohistochemistry and in situ hybridization in normal gastric mucosa (n=15), atypical gastric hyperplasia (n=40) and gastric carcinoma (n=60). RESULTS: The positive rates of ezrin mRNA and protein in normal gastric mucosa, gastric hyperplasia and gastric carcinoma were gradually decreased, and statistical differences among the 3 groups were remarkably significant (P<0.001). The expressions of ezrin mRNA and protein were related to the malignant progression of gastric carcinoma, tumor diameter and lymph node metastasis (P<0.05), but they were not significantly correlated with patients age, gender and vessel invasion (P>0.05). In addition, the expression of ezrin mRNA was positively correlated with ezrin protein (rs=0.990, P<0.01). CONCLUSION: The decreased expressions of ezrin mRNA and protein play an important role in the development of gastric carcinoma.

【Keywords】 stomach neoplasms; ezrin gene; in situ hybridization; immunohistochemistry

0引言

Ezrin属于ERM蛋白家族, 其在肿瘤转移过程中是否发挥主要作用, 目前尚不得而知. 但ezrin参与多种肿瘤转移已被大量实验证实［1-2］. 我们用原位杂交和免疫组化技术检测ezrin mRNA及蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中的表达及其相互关系,以探讨ezrin表达的调控层次及其与胃癌发生、发展和浸润转移的关系.

1材料和方法

1.1材料

200503/200602病理科存档石蜡包埋标本.不典型增生胃黏膜40例,包括轻度16例,中度14例, 重度10例. 胃癌60例, 年龄26~75（中位年龄54）岁，其中高分化腺癌12例, 中分化腺癌20例, 低分化腺癌15例, 黏液腺癌13例; 淋巴结转移阳性31例, 阴性29例; 有脉管侵犯10例, 无脉管侵犯50例. 所有标本术前均未行放疗和化疗, 同时取距离肿瘤组织>5 cm的胃黏膜15例作为正常对照. Ezrin鼠抗人抗体及免疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司. Ezrin mRNA寡核苷酸探针:从GenBank中检索ezrin 基因全序列 (Locus: BC_068458, 3083 bp, mRNA), 选取该序列143~172作为靶位点, 使用Oligo软件设计探针, 由上海生工生物技术服务有限公司合成.

1.2方法

采用免疫组化SP法, ezrin抗体稀释度为1∶100, DAB显色, 苏木素复染. 以PBS缓冲液代替一抗作空白对照. 阳性信号为棕黄色, 定位于胞膜和胞质. 原位杂交:整个操作均在无RNA酶的环境中按常规进行, 组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化, 37℃下蛋白酶消化30 min, 在无水乙醇中脱水10 s, 每张切片上滴加一滴探针溶液, 盖上盖玻片, 37℃过夜. TBS浸泡去掉盖玻片, TBS洗片3×3 min. 加2~3滴地高辛抗体37℃作用30 min. TBS浸泡3 min. DAB显色, 苏木素复染. 杂交阳性信号为棕黄色颗粒, 定位于细胞质. 以TBS缓冲液代探针作阴性对照. Ezrin mRNA阳性表达在胃癌细胞胞质内, DAB显色, 呈棕黄色颗粒, 其蛋白免疫组化染色位于细胞膜与细胞质内, 呈棕黄色. 按染色强度和阳性表达细胞数来判定结果.

统计学处理：使用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，采用χ2检验及Spearman等级相关分析，P<0.05认为有统计学意义.

2结果

2.1胃组织ezrin mRNA和蛋白的表达

Ezrin mRNA在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌细胞胞质中表达信号为阳性(图1A), 其阳性表达率呈递减趋势， χ2检验组间差异性有统计学意义(χ2=23.599, P<0.01); 其蛋白在胞膜和胞质中表达阳性(图1B), 阳性表达率在三组间亦呈递减趋势, 组间差异性有统计学意义(χ2=27.186, P<0.01, 表1). 表1胃黏膜组织ezrin mRNA和蛋白的表达（略）

2.2Ezrin表达与临床生物学行为的关系

经χ2检验,ezrin mRNA和蛋白表达在不同浸润深度、肿瘤大小及有无淋巴结转移组内表达率的差异性有统计学意义(P<0.05, 表1), 而在年龄、性别和脉管侵犯组内差异无统计学意义(P>0.05). Spearman等级相关分析显示ezrin mRNA和蛋白表达呈正相关(rs=0.990, P<0.01).

3讨论

Ezrin是一种细胞骨架连接蛋白,活化的ezrin C端与肌动蛋白细胞骨架连接, N端与多种跨膜分子结合,从而形成专门的膜区域结构, 调节细胞活动如生存、黏附、迁移等, 这些活动在肿瘤发展和进程中均非常重要. 正常卵巢上皮ezrin强表达,而在卵巢癌组织中ezrin表达下调,且ezrin的无表达和弱表达胃腺癌.

与卵巢癌患者不良预后相关［3-4］. 而Wan等［5］在鼠骨肉瘤模型中发现, 通过转染反义ezrin或siRNA阻断ezrin的表达或转染氨基末端显性负相的ezrin破坏其功能都能显著的减少鼠的肺转移. Shen等［6］在研究食管上皮细胞癌时发现, 能发生转移的细胞系Sheemt与不能发生远处转移的细胞系Sheemt相比,其ezrin表达水平显著高于后者.

体外细胞培养表明, ezrin的缺失与肿瘤的运动能力和侵袭性增加有关, 并可影响细胞表面的黏附分子而促进肿瘤的浸润转移［7］. 我们应用原位杂交和免疫组化两种技术对ezrin mRNA与蛋白进行检测, 旨在从转录和翻译水平探讨ezrin基因表达与胃癌发生发展及生物学特征的关系. Ezrin mRNA和蛋白在正常胃黏膜﹑不典型增生胃黏膜﹑胃癌中阳性表达率逐渐降低, 且组间差异性有统计学意义. 在胃癌不同浸润深度、肿瘤大小及有无淋巴结转移组内表达率的差异性亦有统计学意义. 两种检测方法结果一致, 说明在胃癌的发生发展中ezrin基因在转录水平上有ezrin mRNA的低表达, 同时在蛋白水平上ezrin也低表达, 两者呈平行关系. 提示ezrin蛋白表达降低的调控发生在转录水平, 可能有基因的变异存在. 但ezrin mRNA表达阳性率略低于其蛋白的表达，分析其原因可能与组织固定剂及固定时间有关. 本实验结果与Kobel 等［8］报道的ezrin表达水平较低时, 肿瘤细胞的浸润受到抑制不符. 可能的机制是某些涉及ezrin磷酸化激活的机制失调, 导致了ezrin功能增强从而使肿瘤细胞吞噬及转移能力增强, 这也说明ezrin在肿瘤转移过程中的作用机制较为复杂.

【参考文献】
［1］Yu Y, Khan J, Khanna C, et al. Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six1 as key metastatic regulators ［J］. Nat Med, 2004, 10(2):175-181.

［2］张俊会，刘斌，邢传平，等. ezrin, cMet及ICAM1在胃癌组织的表达及其意义［J］. 第四军医大学学报, 2007,28(4):303-306.

［3］Moilanen J, Lassus H, Leminen A, et al. Ezrin immunoreactivity in relation to survival in serous ovarian carcinoma patients ［J］. Gynecol Oncol, 2003, 90(2):273-281.

［4］Song J, Fadiel A, Edusa V, et al. Estradioinduced ezrin overexpression in ovarian cancer: a new signaling domain for estrogen ［J］. Cancer Lett, 2005,220(1):57-65.

［5］Wan X, Mendoza A, Khanna C, et al. Rapamycin inhibits ezrinmediated metastatic behavior in a murine model of osteosarcoma ［J］. Cancer Res, 2005, 65(6): 2406-2411.

［6］Shen ZY, Xu LY, Chen MH, et al. Upregulated expression of Ezrin and invasive phenotype in malignantly transformed esophageal epithelial cells［J］. World J Gastroenterol, 2003, 9(6):1182-1186.

［7］卢航青，郑杰. 埃兹蛋白:生物学特征及其在肿瘤转移中的作用［J］. 细胞生物学杂志，2005,27:257-262.

［8］Kobel M, Gradhand E, Zeng K, et al. Ezrin promotes ovarian carcinoma cell invasion and its retained expression predicts poor prognosis in ovarian carcinoma ［J］. Int J Gynecol Pathol, 2006, 25(2):121-130.