【摘要】 目的 探讨胃癌组织中端粒酶逆转录酶（hTRT）和bcl2蛋白表达及其与端粒酶活性的关系。方法 采用免疫组化SP法对58例胃癌及其相应正常胃黏膜组织中hTRT与bcl2蛋白表达进行检测，并应用PCRELISA法测定上述组织标本中端粒酶活性。结果 hTRT与端粒酶活性在胃癌组织中阳性表达率分别为86.2%和81.0%，而正常胃黏膜组织中均未检测到hTRT或端粒酶活性阳性表达。bcl2蛋白在胃癌和正常胃黏膜组织中阳性表达率分别为77.6%和8.6%，前者显著高于后者（P<0.01）。胃癌中hTRT和bcl2蛋白表达分别与端粒酶活性呈显著正相关（r分别为0.759和0.724，P均<0.01）。结论 hTRT及bcl2蛋白过度表达与胃癌的发生密切相关，并可能参与胃癌端粒酶活性调节。检测hTRT表达水平可作为胃癌的诊断指标之一。

【关键词】 胃肿瘤 端粒酶 基因表达

胃癌是危害我国人民生命和健康的主要恶性肿瘤之一，其发病机制尚未阐明，近年来有资料显示，端粒酶激活与胃癌的发生密切相关[1]。但有关胃癌中端粒酶激活的途径及调节机制仍不清楚。随着对端粒酶结构与功能研究的深入，认为端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTRT）可能在端粒酶活性调节中起重要作用[2]。bcl2作为一种细胞凋亡抑制基因，其过度表达与包括胃癌在内的人类多种恶性肿瘤的关系密切[3]。本文通过检测hTRT、bcl2蛋白及端粒酶活性在胃癌组织中的表达，探讨hTRT、bcl2蛋白表达与端粒酶活性的关系及其在胃癌发生中的作用。

1材料与方法

1.1材料

收集本院及湖北省肿瘤医院2002年10月～2003年10月手术切除的胃癌标本58例，其中男39例，女19例，年龄32～74岁，平均55岁。每例分别取癌组织及距癌6cm左右的正常胃粘膜组织，均经病理学证实。上述所有标本除取一部分做病理组织学检查外，另一部分迅速放入液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱保存待测。所有病例术前均未经放疗和化疗。兔抗人hTRT抗体、鼠抗人bcl2抗体及SP试剂盒购自北京中山生物技术公司。端粒酶活性的PCRELISA检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。

1.2方法

1.2.1hTRT及bcl2蛋白表达检测采用免疫组化SP法。其主要步骤包括：胃组织标本经石蜡切片（5μm），常规脱蜡至水，3%过氧化氢室温10 min以阻断内源性过氧化酶，微波修复抗原（98℃，10 min），滴加一抗（4℃，过夜）及生物素化二抗（37℃，20 min），滴加辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，苏木精复染，脱水至透明封片，显微镜观察。用PBS代替一抗作阴性对照。hTRT及bcl2阳性信号均为细胞质出现棕黄色颗粒，参照国内外标准[4,5]，hTRT、bcl2以阳性细胞数占切片中上皮细胞总数5%以上计为阳性例数。

1.2.2端粒酶活性测定取胃组织标本约50mg， 加入裂解液200μl， 混匀后冰上孵育30 min， 4℃下转速10 000 r·min1离心20min， 收集上清液（即为组织提取液）， 并测定其蛋白含量；取组织提取液1～5μl（含蛋白50 μg）加入25μl TRAP反应液中， 用无菌DEPC水补足至50μl混匀后30℃保温30min， 94℃ 5min灭活端粒酶， 然后按以下条件扩增： 94℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 90s， 循环30次， 最后于72℃延伸10min；将扩增产物在通过ELISA法显色后在酶标仪分别测450nm和690nm吸光度A值， 端粒酶活性等于A450nm～A690nm， 当A450nm～A690nm大于0.2者为端粒酶活性阳性。

1.3统计学处理

采用χ2检验和四格表确切概率法。

2结果

2.1hTRT在胃癌组织中表达58例胃癌组织中检出50例hTRT阳性表达，阳性表达率为86.2%，正常胃粘膜组织中无1例检测到hTRT阳性表达。胃癌与正常胃粘膜组织hTRT阳性表达率差异有非常显著性（P<0.01）,见图1、2。

2.2胃癌组织端粒酶活性及其与hTRT表达的关系 端粒酶活性在胃癌组织中阳性检出率为81.0%（47/58），而正常胃组织均未检出端粒酶活性；二者比较有非常显著性差异（P<0.01）。胃癌组织hTRT表达与端粒酶活性呈显著正相关（r=0.759，P<0.01），见表1。

2.3不同类型胃癌组织hTRT及端粒酶活性表达

胃癌不同组织学类型、分化程度及TNM分期 表1 hTRT表达与端粒酶活性的关系*P＜0.05

2.4胃癌组织bcl2表达及与端粒酶活性表达的关系 bcl2蛋白在胃癌和正常胃粘膜组织中阳性表达率分别为77.6%（45/58）和8.6%（5/58），前者非常显著高于后者（P<0.01），见图3、4。胃癌组织bcl2表达与端粒酶活性呈显著正相关（r=0.724，P<0.01），见表３。表3 bcl2表达与端粒酶活性表达的关系

3讨论

现已知端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，由端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶相关蛋白1 (telomerase associated protein 1, TP1) 和hTRT组成。其中hTR和TP1虽为组成人端粒酶的重要成分，但研究发现它们与人端粒酶活性调节无关[6]。而hTRT为端粒酶活性催化亚单位。Bodnar等[7]将hTRT基因转染端粒酶阴性的细胞后，可使细胞重新获得端粒酶活性，并引起端粒长度增加及细胞寿命延长等一系列改变，从而支持该基因为端粒酶催化亚单位。本研究结果显示，58例胃癌组织中hTRT阳性表达率高达86.2%，而正常胃粘膜组织中未检测到hTRT阳性表达，两组比较差异有非常显著性（P<0.01），且hTRT表达与端粒酶活性呈显著正相关（r=0.759，P<0.05）。表明hTRT表达上调与胃癌的发生密切相关，并可能直接参与胃癌端粒酶活性调节。同时由于hTRT仅在胃癌组织中表达，而正常胃粘膜组织中不表达，提示hTRT表达可作为胃癌的诊断指标之一。

在分析hTRT及端粒酶活性表达与胃癌临床病理关系时，发现hTRT及端粒酶活性表达与胃癌组织学类型、分化程度及TNM分期均无明显相关性。表明端粒酶的激活可能发生在胃癌形成的早期，且在胃癌的进展过程中始终影响胃癌细胞的增殖和分化。

bcl2基因最初在滤泡性B淋巴瘤中发现，它不同于一般意义上加速细胞增殖而致癌的癌基因，它通过抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，使细胞数目累积增多而促进肿瘤形成[3]。但bcl2基因表达是否参与胃癌端粒酶激活目前尚无直接证据。Mandal等[8]在实验中，用含bcl2 cDNA 的质粒转染人宫颈癌Hela 细胞，发现转染阳性Hela细胞的端粒酶活性较未转染的Hela细胞升高5～10倍。本研究结果发现，胃癌组织bcl2蛋白表达阳性率显著高于相应正常胃组织，癌组织中bcl2蛋白表达与端粒酶活性亦呈明显正相关（r=0.724，P<0.05）。提示bcl2蛋白过度表达不仅与胃癌的形成有关，而且可能在胃癌端粒酶活性调节中发挥重要作用。

(本文图见封3)

【参考文献】
［1］ Kakeji Y, Maehara Y, Koga T, et al. Gastric cancer with high telomerase activity shows rapid development and invasiveness[J]. Oncol Rep, 2001, 8（1）: 107110.

[2] Ying J, Zhang B, Hou L, et al. Molecular cloning of hTRT catalytic domain from HeLa cells and its expression in E. coli and purification[J]. Chin Med Sci J, 2000, 15(3): 170174.

[3] Lee HK, Lee HS, Yang HK, et al. Prognostic significance of Bcl2 and p53 expression in gastric cancer[J]. Int J Colorectal Dis, 2003, 18 (6): 518525.

[4] 赵坡, 吕亚莉, 钟梅, 等.结肠直肠癌端粒酶、肝素酶表达升高与预后的关系[J].癌症,2001, 20 (6): 624627.

[5] Jorge O, Cuello Carrion FD, Jorge A,et al. Helicobacter pylori infection affects the expression of PCNA, p53, cerbB2 and Bcl2 in the human gastric mucosa[J].Rev Esp Enferm Dig, 2003, 95(2): 97104.

[6]Arinaga M, Shimizu S, Gotoh K, et al. Expression of human telomerase subunit genes in primary lung cancer and its clinical significance[J]. Ann Thorac Surg, 2000,70(2):401405.

[7]Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, et al. Extension of lifespan by introduction of telomerase into human normal cells[J]. Science, 1998, 279(5349): 349352.

[8]Mandal M, Kumar R. Bcl2 modulates telomerase activity[J].J Biol Chem, 1997, 272 (22): 1418314187