【摘要】 目的 探讨生存素（Survivin）mRNA在胃癌组织中的表达与临床病理及其预后的关系。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测41例胃癌患者与9例良性胃疾病患者手术标本中的Survivin mRNA表达并随访3 年，将其表达及表达强度与临床病理特征进行相关分析。结果 胃癌组织中Surviving mRNA的阳性率（70.7%）均高于癌旁正常组织（17.1%）和良性胃疾病患者组织Survivin mRNA表达的阳性率（1/9）（P＜0.005）癌旁正常组织与良性胃疾病组织Survivin mRNA表达的阳性率差异无显著性（P＞0.05）；Survivin mRNA在胃癌组织的表达及表达强度与年龄、性别、病理分型、分期、解剖部位及淋巴结和（或）远处转移均无明显关系（P＞0.05），但与预后有明显关系（P=0.001 8）。结论 胃癌组织检测Survivin mRNA表达可以作为胃癌诊断的特异性分子标志物之一，且可独立作为预测肿瘤的预后。

【关键词】 胃肿瘤；生存素；mRNA；预后

Expression of Survivin m RNA in Gastric Carcinoma Tissue and Its Relationship with Prognosis

Chen Hongshen, Yin Jiajun

(Department of General Surgy, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian Universily, Dalian 116001, China)

Abstract： Objective To assess the value of the detection of survivin m RAN in gastric carcinoma tissues. Methods Carcinomatou and para-carcinomatous normal tissues of 41 patients with gastric carcinoma and specimen of nine patients with benign gastric diseases were collected. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) was performed to detect the survivin m RNA expression in the specimens. All the patients were followedup for three years. The results were analyzed relatively.Results The positive rate of survivin m RNA was higher in the carcinomatous tissues (70.7%) than in the paracarcinomatous normal tissues (17.1%) and the benign gastric diseases tissues (1/9) (P＜0.005). There was no signifcant difference between the paracarcinomatous normal tissues and the benign gastric disease tissues (P＞0.05). Survivin m RAN expression was not related to age, sex, histological subtype, differentiation, pathologic grading or lymph node metastases.Conclusion Expression of survivin m RAN in the gastric carcinomatous tissue can be used as a specific molecular marker for the diagnosis of gastric carcinoma. It can act as an independent prognostic factor.

Key words： gastric carcinoma; survivin; m RNA; prognosis

分子生物学研究表明，胃癌是一种基因性疾病，癌基因的激活和抑癌基因的失活导致胃癌细胞的增殖异常和凋亡障碍是其发生发展的关键，且基因的异常早于形态学改变。Survivin表达于人类大多数肿瘤组织中，而在正常成人组织中不表达（除胸腺外）。Survivin基因不仅能够抑制凋亡而且在促进细胞增殖、细胞转化中具有重要作用[1,2]。作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成员之一，Survivin独特的功能在肿瘤的发生发展中的作用愈来愈受到人们的重视。本研究采用RTPCR方法检测胃癌患者手术标本中Survivin mRNA的表达，并随访3年，将是否表达、表达强度与临床病理特征、预后进行相关分析，以探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本取自我院普外1999—2002年50例手术患者。41例经病理组织学确诊为胃癌，其中男34例，女7例；年龄35~76岁。留取标本的患者术前均未进行过化疗和放疗。高分化22例，中分化12例，低分化7例；病理Ⅰ期3例，Ⅱ期24例， Ⅲ期7例，Ⅳ期7例；伴有淋巴结转移者22例，不伴有转移者19例。同时留取癌旁正常组织41例。良性胃病9例，作为阴性对照，男8例，女1例；年龄26~63岁。

1.2 主要试剂

Trizol（Biobasic公司，上海生工生物工程技术公司分装）；逆转录试剂盒（fermentas公司）；dNTP，Taq DNA 聚合酶（上海生工生物工程技术公司）；DL2000 DNA markers（MBI fermentas公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、超纯水、琼脂糖、溴化乙绽（EB）、溴酚蓝（上海生工公司）；PBS（经DEPC处理），电泳缓冲液（TBE）、氯仿、异丙醇、75%乙醇（经DEPC处理）（自备）。

1.3 方法

1.3.1 标本的取样与保存

胃癌组织取自肿块中央非坏死部分，癌旁正常组织取自远离肿块5 cm 以上大体形态学正常的胃组织，良性胃疾病组织取自病变最严重部位。组织离体后分成两部分，分别用于做病理组织学和Survivin mRNA表达测定。用于测定Survivin mRNA表达的组织即刻用DEPC处理的冷磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次，去除血迹。1 h内放入液氮速冻，在-80℃冰箱保存。

1.3.2 RTPCR法检测Survivin mRNA表达

（1）提取RNA：取组织50~100 mg 在液氮中速冻，玻璃匀浆器中彻底匀浆。按Trizol试剂盒（上海生工生物工程技术公司产品）说明书用一步法提取总RNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。（2）逆转录合成cDNA：取上述提取的RNA5 μl，寡聚脱氧核苷酸12-18[Oligo(dT)12-18]1 μl，加去离子水6 μl，共12 μl 置于PCR管中涡旋器上轻微混匀3~5 s，以上均冰上操作。70 ℃ 孵育5 min 后，冰上冷却，400 r/min 离心10 s。将PCR管置于冰上操作，分别加入：5×反应缓冲液4 μl，RNA酶抑制剂（20 U/μl）1 μl，10 mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸混合液（dNTP）2 μl，混匀，400 r/min，离心10 s，收集产物。37 ℃ 孵育5 min。加Moloney小鼠白血病病毒（MMuLV）逆转录酶（200 U/μl）1 μl，终体积为20 μl。42 ℃ 孵育60 min。70 ℃ 加热10 min，冰上冷却后即完成cDNA的合成。置-20 ℃ 保存。（3）检测Survivin mRNA 表达Survivin基因引物设计按参考文献[6]，由上海生工生物工程技术合成，序列如下：5' GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT 3'（Survivin mRNA第94~113bp），5' GCA CTT TCT TCG CAG TTT CC3'（Survivin mRNA第424~443 bp）。目的基因338bp。β actin引物设计按参考文献[3]，由上海生工生物工程技术合成，序列如下：（F）5' CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGC GAC C3'，（R）5' CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G 3'。目的基因600bp。检测逆转录效率。在25 μl 反应体系中含有上述合成的cDNA 1 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 mmol/L MgC12 1.5 μl，0.5 μmol/L上下游引物各0.5 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U（0.25 μl），5×Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μl，加超纯水至25 μl。进行热循环扩增，反应条件为：9.5 ℃，变性1 min；55 ℃，退火1 min，72 ℃，延伸1 min，共31个循环。

1.3.3 病理组织学检查

病理组织切片苏木精伊红（HE）染色由我院两位病理学专家阅片作出病理诊断。

1.4 结果判定

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳[4]（电压按8V/cm，电流20 mA），溴化乙绽（EB）显色，用内参照βactin检测逆转录效率。紫外线透视下观察结果，可检测到338 bp 阳性条带（Surviving mRNA）和600 bp 的条带（βactin）。DL2000 DNA markers为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。凝胶成像系统进行摄像并半定量分析。

1.5 统计学方法

采用方差分析、t检验、χ2检验、秩和检验和四格表确切概率法。

2 结果

2.1 胃癌组织、癌旁正常组织及良性胃疾病组织手术标本Survivin mRNA表达情况

胃癌手术标本癌组织Survivin mRNA表达的阳性率70.7%(29/41)明显高于癌旁正常组织17.1%（7/41）及良性胃病组织（1/9）（P<0.005和χ2=8.59，P<0.005）；癌旁正常组织与良性胃病组织Survivn mRNA表达的阳性率差异无显著性（χ2=0.001，P>0.05），详见表1。表1 癌旁正常组织、胃癌组织手术标本Survivin mRNA表达比较（略）

2.2 胃癌组织Survivin mRNA表达及表达强度与临床病理特征的关系

将Survivin mRNA表达产物进行半定量（即Survivin mRNA条带在凝胶图像的平均密度/βactin条带在凝胶图像的平均密度），则可以发现Survivin mRNA在胃癌组织表达及表达的强度与年龄、性别、分期、病理分期及是否伴有淋巴结和远处转移均无明显关系（P>0.05），但与生存期有明显关系（P<0.01），详见表2。表2 患者临床病理特征与胃癌组织Survivin mRNA表达及表达强度的比较
（略）

3 讨论

肿瘤的发生存在基因改变的复杂性和多因素性，但细胞增殖和凋亡调控失常是普遍存在的因素。胃癌是临床常见的恶性肿瘤，许多与凋亡和增殖有关的基因如cmyc，p53， 凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）基因家庭等都被发现在胃癌中存在基因突变或异常表达。Survivin基因是1997年Altieri发现，定位于染色体17 q25区。研究表明Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，能够抑制Caspase3、 Caspase7、 Fax、 bax以及一些放疗、化疗诱导的凋亡[5]。在100多种肿瘤特异性表达基因中，其表达的特异性列前4位[6]。生理状态下，在成人除子宫内膜组织、胎盘和胸<