【关键词】 人乳头瘤病毒

关键词: 人乳头瘤病毒;胃肿瘤;聚合酶链反应;病因学

中图号:R735.2

摘 要:目的 研究西安地区人乳头瘤病毒（HPV）的感染与胃癌的关系. 方法 运用PCR方法，同时设计HPV共同引物和HPV16型和HPV18型巢式引物，对胃癌组织（n=40）、癌旁组织和非肿瘤组织（n=10）进行HPV DNA的检测. 结果 胃癌40例组织中HPV检出15例，总检出率为37.5%;癌旁组织和非肿瘤组织未检出.HPV的检出以HPV16型为主，占检出阳性的80.0%，且与癌组织的分化程度密切相关. 结论 HPV的感染，主要为高危型HPV16型的感染与本地区胃癌的病因学可能关系密切.

Significance of human papillomavirus infection in gastric carcinoma

ZHANG Wei-Long，LI Chen-Hao，XIAO Bing，DING Jie，MIAO Ji-Yan，FAN Dai-Ming

Institute of Gastrointerstinology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical Universi-ty，Xi'an710033，China

Keywords:human papillomavirus;stomach neoplasms;poly-merase chain reaction;etiology

Abstract:AIM To study the relationship between HPV in-fection and gastric carcinoma in Xi'an area.METHODS Polymerase chain reaction（PCR）method was used in this study to detect the HPV DNA sequences in gastric carcinoma tissue.RESULTS Of40cases of gastric carcinoma tissues，15were found HPV positive，with a detection rate of37.5%.No HPV was detected in para-cancerous and non-tumorous tissues.Those detected in gastric carcinoma groups were mainly of type16，accounting for80%of total HPV detect┐ed.CONCLUSION HPV infection，especially high-risk type16of HPV，might be closely related to the etiology of gastric carcinoma in Xi'an area.

引言

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）与许多常见病有关，可以在人群中广泛传播和感染.HPV可引发皮肤和粘膜的良性乳头瘤或疣，其中部分经数年至数十年可以转化成癌［1，2］ .近年发现HPV的感染与消化道肿瘤有关系［3-5］ ，但有关胃癌与HPV感染关系的报道很少［6］ .因此，研究本地区HPV的感染与胃癌的关系，可以在本地区胃癌的病因学及发病机制方面给我们某些提示，为肿瘤的预防和治疗提供参考.

1 材料和方法

1.1 材料

癌组织检测样本40例，为新鲜胃癌组织标本，18例取自西京医院和唐都医院行胃癌切除术的患者;22例取自西京医院门诊胃镜行活组织检查的患者.所选样本均为西安地区胃癌散发患者.其中，高分化腺癌8例，中分化腺癌10例，低分化腺癌22例，所有标本均经病理科医师诊断证实.取材后于30min内置液氮中保存.癌旁对照样本，为取远离癌灶的手术切缘处组织，病理诊断报告为手术切缘干净，无癌细胞浸润.取活检组织标本，远离病变部位5cm以上，内镜下观察正常的粘膜组织.非瘤对照胃粘膜组织10例，来自西京医院门诊内镜活检组织，病理诊断均为非瘤组织.pUC18 -HPV16和pUC19 -HPV18质粒DNA，由中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室李洁惠赠.

1.2 方法

PCR检测样本组织HPV的DNA:组织细胞中基因组DNA及HPV16，HPV18质粒DNA提取按照文献［7］报道的方法和注意事项操作.同时设计HPVs共同引物和HPV16型和HPV18型巢式引物.引物序列参照Pao等［8］ 的文献设计，由美联生物技术工程有限公司合成提供和由Dr.Pao惠赠（Dept.Biochemistry，Chang Gung Med.College，Taipei，Taiwan，China）.引物序列及产物大小见Tab1.

表1 PCR引物序列(略)
Tab1 Sequence of PCR primers

组织细胞DNA模板先经HPV共同引物扩增;再以共同引物扩增阳性的DNA为模板，分别进行HPV16，HPV18型特异性巢式引物扩增，鉴定型别.每次扩增均以HPV16和（或）HPV18质粒DNA为阳性对照，不加模板DNA为阴性对照.反应体积为50μL，在0.5mL Eppendorf管中依次加入10×反应缓冲液5μL，200μmol・L-1 dNTP5μL，20mmol・L-1 MgCl2 3μL，引物对2μL（0.2μmol・L-1 ），高纯水26μL，模板DNA3μL（0.5～10mg・L-1 ），混匀后于94℃预变性5min，冰浴中加入6μL（3U）Taq DNA聚合酶，混匀，稍加离心，覆盖灭菌石蜡油30μL，进行PCR扩增.循环参数:94℃变性40s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个周期后，最后72℃保温10min终止.HPV16，HPV18巢式引物的扩增，先进行第1对引物扩增后，取扩增产物3μL为模板，再行第2对引物扩增，反应体积及循环参数同前.PCR产物用20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，254nm紫外灯下观察扩增条带、记录、照像.PCR结果判定，以DNA标准品pBR322BnstⅢ为Marker，其各带大小分别为1857，1060，929，383bp.HPVs共同引物扩增的产物为在383～929bp中间出现一条电泳带，HPV16在383～929bp之间略靠近383bp处出现一条电泳带，HPV18在靠近383～929bp之间靠近929bp处出现一条电泳带.当HPV16，HPV18质粒DNA扩增出HPVs，HPV16，HPV18的相应条带，而空白对照未扩增出任何条带时，认为组织细胞总DNA扩增结果可靠.

统计学处理:实验结果采用χ2检验.

2 结果

2.1 胃癌组织HPVs DNA扩增结果

胃癌组织及其癌旁组织各40例，非瘤的胃粘膜组织10例，经HPVs共同引物扩增后，胃癌组织阳性者15例，检出率为37.5%，癌旁组织和非肿瘤组织均未检出（Tab2，Fig1）.

表2 胃癌组织HPVs DNA检测结果）（略）
Tab2 HPVs DNA in gastric carcinoma tissues

图1 胃癌组织HPVs共同引物扩增电泳结果（略）
Fig1 HPVs DNA in gastric carcinoma tissues

40例胃癌组织中，高、中分化腺癌18例，检出HPVs DNA阳性3例，检出率为16.7%，低分化腺癌22例，检出HPVs DNA阳性12例，检出率为54.5%，低分化腺癌的检出率与高、中分化腺癌的检出率比较差异显著（P<0.05，Tab3）.

2.2 胃癌组织感染HPV的型别及与癌组织分化程度

胃癌组织40例，检出HPVs DNA阳性15例，其中HPV16型12例，占80.0%，HPV18型1例，占6.7%，未知型2例，占13.3%（Tab4，Fig2，3），未检出双重感染.胃癌组织标本40例中，从手术切除获取的标本18例，检出HPVs DNA阳性8例，检出率为44.4%;从胃镜活检获得的标本22例，检出HPVs DNA阳性7例，检出率为31.8%.两种取材方式比较，HPVs DNA阳性检出率无显著差异.

表3 不同分化程度的胃癌HPVs DNA检测结果（略）
Tab3 HPVs DNA in gastric carcinoma with different differ-entiationDifferentiation n HPV sDNA

表4 HPV不同型别与胃癌分化程度的关系（略）
Tab4 Relationship between HPV types and gastric carcino-ma with different differentiation

图2 胃癌组织HPV16巢式引物扩增电泳结果（略）
Fig2 HPV16DNA in gastric carcinoma tissues

3 讨论

胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，占恶性肿瘤死亡率的第一位［9］ .随着分子生物学的进展及对癌基因、抑癌基因的深入研究，认为人体组织细胞的程序性死亡或凋亡的时间、速度和数量均受到基因的严密控制［10］ ，而肿瘤病毒的DNA、蛋白质可能与某些调控细胞凋亡的基因DNA片段结合，干扰这些基因信息的传递、转录、复制，使其在错误的时间和（或）环节上调控细胞的生命周期，使细胞不能按正常程序死 亡，而向恶性化方向发展，导致癌的发生［11］ .

图3 胃癌组织HPV18巢式引物扩增电泳结果）（略）
Fig3 HPV18DNA in gastric carcinoma tissues

HPV已证实与人类多种肿瘤相关.至今已分离出的致瘤性HPV有70多种，根据其致癌性分为低危型和高危型两型.低危型如HPV6，HPV11型，高危型如HPV16，HPV18型.高危型HPV的致癌中心环节是HPV转化蛋白E6，E7与抗癌基因的失活，特别是与p53相互作用的结果.近年来，HPV的感染与消化道肿瘤的关系已日益受到重视，但有关HPV的感染与胃癌的关系报道甚少.本研究采用敏感的PCR方法检测了胃癌及其癌旁组织和非肿瘤组织的HPV感染率，HPV总检出率为37.5%（15/40），以HPV16型居多，占检出阳性的80.0%;另外，也检出1例HPV18型，还有2例型别不清.由此看出，本地区胃癌HPV16型的感染为多，但也不排除有HPV18和其他型别的可能.以往人们多认为HPV仅感染某些器官的鳞状上皮［12］ ，腺上皮的HPV的感染结论不甚相同［13，14］ ，但有许多学者［4，5］ 报告，在结肠腺肿瘤或结肠癌细胞系中都证明有HPV DNA存在.我们通过对胃癌的检测，在胃腺癌的组织中，也检测到了HPV的DNA片段，看来，HPV感染腺组织细胞是可能的.HPV的致癌机制目前研究表明［15，16］ ，当HPV基因处于整合状态时，有E2，E4，E5和L2基因不同程度的缺失，但URR，E6，E7往往优先保留下来.因此，强烈提示E6，E7是癌基因
［17］ .参与细胞转化并起主要作用的是高危型HPV E6，E7基因片段.在p53作为抑制基因功能丧失中，HPV的感染是其原因之一.HPV感染后可以经插入等方式整合到人染色体的某一位点而致p53突变.此外，高危型HPV16和HPV18编码的癌蛋白E6可以和野生型p53结合形成复合物导致p53的降解和灭活.HPV16，18感染所致的p53突变或降解、失活均可导致细胞的生长调控异常，这可能是HPV感染后致细胞表型转变的关键因素之一.E7蛋白也可与Rb结合，使肿瘤抑制基因Rb不能与