【摘要】 目的 探讨胃癌组织中p15、p16和nm23蛋白的表达及其相关性。方法 应用免疫组织化学SP方法检测52例患者手术切除胃癌组织中p15、p16和nm23蛋白的表达水平。结果 p15、p16和nm23蛋白在胃癌组织中的阳性率分别为42.3%、44.2%、40.4%；p16蛋白表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期和患者生存期在统计学上均差异显著(P<0.05)，而与胃癌的组织学类型无关(P>0.05)；nm23蛋白表达与淋巴结转移、肿瘤分期和患者生存期有显著性差异(P<0.05)，与胃癌的组织学类型和胃癌的分化程度无关(P>0.05)；p15蛋白表达与胃癌临床病理特征无相关性(P>0.05)；p15、p16和nm23蛋白在胃癌中的阳性表达两者间呈正相关(P<0.05)。结论 联合检测P15、P16和nm23蛋白的表达可为临床判断胃癌生物学行为及评估预后提供客观的参考指标。

【关键词】 胃癌 p15 p16 nm23蛋白 免疫组织化学

胃癌在我国是一种最常见、死亡率较高的消化系统恶性肿瘤,严重威胁人们的健康。随着分子生物学对肿瘤分子机制的深入研究，越来越认识到肿瘤形成及其发展是由于多基因、多因子共同作用积累的结果。因此，探讨胃癌发生发展规律,寻找与其相关的生物标志物是胃癌研究的一个重要课题。我们采用免疫组化SP法对52例手术切除胃癌组织石蜡标本联合检测了p15、p16抑癌基因、nm23转移抑制基因编码产物的表达,可为临床判断胃癌生物学行为及评估预后提供客观的参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集一重集团公司医院病理科1991~2004年存档石蜡包埋组织标本52例,所有患者手术前均未进行过放疗或化疗，经病理诊断证实管状腺癌 24例，粘液腺癌18例，低分化腺癌10例，高、中分化30例,低分化22例,其中伴淋巴结转移者30例；按TNM分期方案，Ⅰ期 4 例，Ⅱ期 9 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期 16 例；男30例,女22例，年龄35~78岁,平均57岁，并按肿瘤组织分化程度、有无淋巴结转移、临床分期及患者生存期进行实验分组。

1.2 主要试剂及方法

一抗分别为鼠抗人p16单克隆抗体（稀释浓度1∶100）、鼠抗人p15单克隆抗体（稀释浓度1∶100）、兔抗人nm23多克隆抗体工作液及SP超敏即用型试剂盒等均由福州迈新生物技术开发公司提供。组织经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋，切片厚度4μm，连续切片分别做常规HE和免疫组织化学SP染色,免疫组织化主要操作步骤:严格按试剂盒说明书进行。阴性对照用PBS代替一抗,用已知的阳性组织切片作阳性对照。

1.3 实验结果判定

p16蛋白阳性着色主要定位于胞浆,部分胞核呈阳性染色，胞浆呈棕黄色或呈明显棕黄色颗粒（图1见封四）；p15蛋白蛋白主要以细胞浆出现棕黄色染色为阳性,可同时伴或不伴有胞浆弥漫性着色（图2见封四）。nm23蛋白定位于胞浆（图3见封四）。镜下观察10个高倍镜视野（10 ×40）,并根据阳性细胞占视野中癌细胞总数的比例分为（-）：细胞内无棕黄色着色，或与切片背景染色一致者；（+）：阳性细胞＜25%；（++）：阳性细胞为25%-50%；（+++）：阳性细胞＞50%。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，组间数据用χ2检验及相关分析。

2 结果

2.1 p15、p16和nm23蛋白表达与胃癌临床病理指标的关系

见表1。表1 p15、p16和nm23表达与胃癌临床病理各指标的关系(略) 注：*P<0.05。

p15、p16和nm23蛋白在胃癌组织中的阳性率分别42.3%、44.2%、40.4%；p16 蛋白表达与胃癌的组织学类型无关(P>0.05)；nm23 蛋白表达与胃癌的组织学类型和组织学分级无关(P>0.05)。高中分化胃癌p16蛋白表达率明显高于低分化者；有淋巴结转移组p16、nm23 蛋白表达率明显低于无淋巴结转移组；肿瘤Ⅰ和Ⅱ期p16、nm23 蛋白表达率明显高于Ⅲ和Ⅳ期者（P<0.05）；患者生存期＞3年组p16、nm23 蛋白表达率与≤3年组有显著性差异(P<0.05)；p15蛋白表达与胃癌临床病理特征无相关性(P>0.05)。

2.2 p15、p16和nm23蛋白在胃癌组织中表达的相关性分析

结果显示：在胃癌组织中p15与 p16表达呈正相关(P<0.05),nm23表达与p15表达呈正相关(P<0.05),nm23表达与 p16表达呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

近年来研究证实，细胞周期调节失控是肿瘤发生发展的重要机制。p16基因在生物学功能上与细胞周期密切相关,其编码的p16蛋白是周期素依赖激酶(CDK)的抑制剂［1］,通过特异地结合CDK4,与cyclinD1起竞争作用,从而抑制G1-S调控点,对细胞周期起负性调控作用［2］。当p16蛋白表达缺失或活性丧失都可导致细胞呈失控性生长，细胞无限分裂增殖,最终导致肿瘤的形成。研究表明，许多肿瘤的发生(如肺癌、乳腺癌、食管癌)与p16突变或缺失有关［3］。本实验结果显示：p16蛋白在胃癌组织中的阳性率 42.3%；p16蛋白表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移和肿瘤临床分期在统计学上差异显著(P<0.05)，提示p16蛋白阳性率随着胃癌恶性进程的发生而降低，这说明p16基因失活，以至p16蛋白下调可能是影响胃癌组织分化、浸润和转移等生物学特性的一个重要因素。且p16蛋白阳性表达者患者生存期＞3年组与≤3年组有显著性差异(P<0.05)，即p16蛋白表达率越高者，患者预后越佳，故p16蛋白还可作为临床评估患者预后的参考指标。p15基因也是一种细胞周期依赖性激酶抑制因子，与p16基因具有相类似的生物学活性，它由多功能多肽TGF-B介导而发挥作用［4］，TGF-B诱导p15量增加,p15与CDK4/6结合,抑制Cyclin-CDK4/6复合物,阻止G1至S期的转变,减少细胞增殖，从而参与细胞周期的调控。有研究资料表明p15基因及其编码产物在多种人类原发性肿瘤和细胞系中发生改变［5］，提示p15基因在肿瘤发生发展过程具有重要的作用。研究认为p15基因纯合子缺失或过度甲基化是p15失活的主要机制,据统计80%的癌细胞株有p15抑癌基因的失活［6］。本研究对52例胃癌p15蛋白检测发现，p15蛋白在胃癌组织中阳性表达率44.2%,p15的表达与胃癌的临床病理特征无相关性，说明p15基因失活可能是胃癌发生的早期事件，而与胃癌病程进展无关［7］。nm23基因是Steeg等［8］1988年应用差别筛选cDNA文库方法从小鼠黑色素瘤K-1735细胞株中分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因,它定位于人体17号染色体长臂(17q22)，编码产物为由152个氨基酸组成的17KD的蛋白质。研究已证实,nm23基因能够抑制肿瘤的形成和转移，在肿瘤发展过程中发挥负性调节作用［9］，而且其缺失、扩增和突变在人类恶性肿瘤中普遍存在，并与肿瘤转移有关［10］。研究还发现［11］,nm23蛋白与二磷酸核苷激酶(NDPK)有相同的氨基酸序列和NDPK酶的活性,因而认为nm23抑制转移能力可能与发挥NDPK作用有关。NDPK生物学功能是调节三磷酸核甘生物合成，通过影响微管聚合状态及G蛋白的信号传导通路而改变细胞的运动，进而参与肿瘤的侵袭与转移过程。本研究结果:nm23表达与胃癌组织学分型无关(P>0.05)，但与肿瘤分化、临床分期、淋巴结转移及患者生存期有关(P<0.05)，与文献报道相一致［12］，本实验也表明癌组织中nm23的阳性表达率随着肿瘤分化程度的降低以及临床分期增加而降低,提示nm23转移抑制基因在胃癌组织分化、浸润及转移方面起着重要的作用。而nm23阳性表达者癌细胞淋巴结转移率明显低于阴性表达者，揭示nm23蛋白在胃癌的淋巴结转移中可抑制癌细胞转移而发挥着负性调控作用。本实验结果还发现在胃癌组织中p15、p16、nm23蛋白表达两者之间呈正相关(P<0.05),p15、p16和nm23在胃癌组织阳性表达存在一致性，提示它们可能相互协同影响胃癌发生、细胞分化、浸润和转移等病理过程,其机制有待进一步探讨。

【参考文献】
［1］Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator poltencially involved in genesis of manymor types［J］.Science,1994,264:436

［2］Nevins JR.E2F:a 1ink between the Rb tumor supperssor protein and viral oncoproteins［J］.Science,1992,258(5081):424-429

［3］刘铁菊,牛昀,于泳,等.乳腺轻、重度乳头状瘤和导管内癌中P16蛋白表达的比较观察［J］.中国肿瘤临床,2002,6:384

［4］Hannon GJ,Beach D.P15(INK4B)is potential effector of TGF-B-induced cell cyclearrest［J］.Nature,1994,371:257-261

［5］Her JG，Jen J,Merlo A,et al.Hypermethation assocrated inactivation indicates a tumor suppresson role for p15 INK4B［J］.Cancer Res,1996,56:722-727

［6］Stone S,Dayanath P,Jiang P,et al.Genomic structure,expression and mutational analysis of the P15(MTS2)gene［J］.Oncogene，1995，11:987-991

［7］王天宝，高鹏，曲延刚，等.p15、p16在胃癌中的表达及意义［J］.中国肿瘤与康复，2001，8（2）：23-24

［8］Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst，1988，80(7):200-204

［9］Ranjit S,Shi YF,Zou MJ.Effects of cytokine mediated modulation of nm23 expression on the invasion and metatic behavior of B16F10 melanoma cells［J］.Int J Cancer,1995,60:204-205

［10］Okada K,Urano T,et al.Isolation of human nm23 genomes and anal