【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子C（VEGFC）及其受体VEGFR3（FLT4）mRNA在胃癌组织中的表达。方法 采用逆转录聚合酶链反应技术对34例胃癌和癌旁组织及16例正常胃黏膜组织中VEGFC及FLT4 mRNA的表达水平进行检测。结果 VEGFC与FLT4 mRNA在胃癌和癌旁组织中均有表达；VEGFC及FLT4 mRNA在胃癌、癌旁组织和正常胃黏膜组织中的表达有明显差异（χ2=23.87、18.97，P<0.05）；VEGFC及FLT4 mRNA在胃癌组织中的表达呈明显正相关（r=0.67，P<0.05）；VEGFC及FLT4 mRNA的表达与胃癌淋巴转移均呈明显正相关（r=0.52、0.52，P<0.05）；VEGFC mRNA在高、中和低分化胃癌组织中的表达有明显差异（F=21.04,P<0.05）；BorrmannⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胃癌组织中VEGFC mRNA的表达有明显差异（F=57.94，P<0.05）。结论 VEGFC及其受体FLT4在胃癌的发生发展过程中可能起一定的作用；两者高表达可能与胃癌淋巴结的转移有关。

【关键词】 胃肿瘤 血管内皮生长因子C 基因表达

EXPRESSION OF VEGFC AND ITS RECEPTOR FLT4 mRNA IN THE GASTRIC CARCINOMAMU LINSONG, SONG XIUQI, SUN SHAOJIE (Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266042, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of vascular endothelial growth factorC (VEGFC） and its receptor VEGFR3 (FLT4) at the mRNA level in gastric carcinoma.MethodsExpressions of VEGFC and FLT4 were studied by semiquantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) among patients with gastric carcinoma (n=34) and adjacent normal tissues from the same patients.ResultsVEGFC and FLT4 were expressed in the tissue of the cancer and adjacent tissue. Significant differences in expressions of VEGFC and FLT4 were noticed among the cancer, adjacent tissue and normal tissue samples (χ2=23.87，18.97;P<0.05）, and a positive correlation between VEGFC and FLT4 expression observed in the tissue of the cancer (r=0.67,P<0.05). With regard to VEGFC and FLT4 expression, there was a significant difference between positive and negative lymph node metastases (r=0.52;0.52,P<0.05).ConclusionVEGFC and its receptor FLT4 may play an important role in the development of gastric cancer, and the over expression of both of them are more likely involved in lymph node metastasis.

［KEY WORDS］stomach neoplasms; vascular endothelial growth factor C; gene expression

恶性肿瘤具有侵袭性和转移性的特点，其转移程度的不同决定了病人的预后[1]。胃癌的发病率居所有恶性肿瘤第二位[2]，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的转移方式以淋巴转移为主，而淋巴转移的机制目前尚不很明确。血管内皮生长因子C（VEGFC）及其受体2（VEGFR2）在胃癌血行转移中的作用已经被证实[3]，但目前VEGFC和血管内皮生长因子受体 3（FLT4）在胃癌淋巴管形成、淋巴转移中作用尚未得到证实[3]。本研究试图应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测VEGFC及其受体FLT4在胃癌及癌旁组织中的表达，探讨VEGFC及其受体FLT4 mRNA在胃癌淋巴管形成及淋巴结转移中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2006年3月～2006年6月，青岛大学医学院附属医院普外科胃癌手术病例34例，其中男22例，女12例；年龄27～76岁，平均57岁。所有病例均经病理证实，且未行术前放、化疗。手术中尽快取新鲜癌组织及癌旁组织，立即放入-70 ℃冰箱中保存。34例胃癌组织中BorrmannⅠ型4例，Ⅱ型10例，Ⅲ 型14例，Ⅳ型6例。高分化10例，中分化7例，低分化17例。同期青岛大学医学院附属医院胃镜室行胃组织病理检查病人16例作为对照，其中男9例，女7例；年龄25～81岁，平均年龄51岁；所取新鲜标本经病理证实为正常胃黏膜组织，并经证实无其他影响VEGFC及FLT4表达的因素；将新鲜组织尽快放入-70 ℃冰箱中保存。

1.2 主要试剂

Trizol由INVITROGEN公司提供。RTPCR一步法试剂盒由QIAGEN公司提供。DNA Marker 由北京鼎国生物技术有限公司提供。

1.3 VEGFC和FLT4 mRNA的检测

1.3.1 总RNA提取 总RNA通过Trizol一步法提取，并溶解于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的无RNA酶的水中，－70 ℃保存。RNA质量和纯度通过标准紫外分光光度计检测，A260/A280以1.75～1.95为宜。总RNA中以mRNA为主，mRNA作为RTPCR模板。

1.3.2 引物设计 GAPDH引物：上游为5′ACTGCCACCCAGAAGACT3′，下游为5′GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′，长度为292 bp，退火温度为58 ℃。VEGFC引物：上游为5′TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC3′，下游为5′ACTCCAAACTCCTTCCCCACAT3′，长度为137 bp，退火温度为58 ℃。FLT4引物：上游为5′ACCGAGGTCATTGTGCATGAA3′，下游：5′CTCCACAAACTCGGTCCAGGT3′，长度为570 bp，退火温度为60 ℃。

1.3.3 RTPCR 根据QIAGEN一步法使用说明书的要求，将超纯水10 μL、5×Buffer 10 μL、dNTPMix 2 μL、5×QSolution 10 μL、上游引物5 μL、下游引物5 μL、Enzyne Mix 2 μL、Template RNA 6 μL 配成总共50 μL体系，在PCR仪上进行反应。反应条件为：50 ℃预变性30 min，95 ℃逆转录15 min；然后94 ℃ 变性1 min， 58 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环34次；最后72 ℃ 再延伸10 min。

1.3.4 电泳 将PCR产物在含有溴化乙锭（EB）的25 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上显色拍照并记录所得图像。对所得条带经Biocaptmw软件进行分析，然后将VEGFC和FLT4条带灰度值与对应的GAPDH灰度值进行比较并进行半定量分析。

2 结 果

2.1 VEGFC和FLT4的表达

在34例胃癌及癌旁组织中，癌组织VEGFC阳性表达25例，FLT4阳性表达22例；癌旁组织VEGFC阳性表达7例，FLT4阳性表达6例； 16例正常胃组织中， VEGFC阳性表达3例，FLT4阳性表达3例。VEGFC 及FLT4 mRNA在胃癌、癌旁、正常组织中表达有明显差异（χ2=23.87、18.97，P<0.05）；两者在胃癌与癌旁及正常组织中表达有显著差异（χ2=9.19～19.13，P<0.05）；两者在癌旁及正常组织中的表达没有明显差异（P>0.05）。

2.2 VEGFC和FLT4 mRNA表达的相关性

在25例VEGFC表达阳性的胃癌组织中， FLT4阳性表达21例，而9例VEGFC表达阴性的胃癌组织中， FLT4阳性表达1例。VEGFC和FLT4在胃癌组织中的表达呈明显正相关（r=0.67，P<0.05）。

2.3 VEGFC和FLT4与胃癌淋巴转移的相关性

在有淋巴结转移的27例胃癌组织中，VEGFC mRNA表达阳性者23例，FLT4 mRNA表达阳性者23例；而7例无淋巴结转移胃癌组织中，VEGFC表达阳性2例，FLT4 mRNA表达阳性者2例。VEGFC及FLT4 mRNA的表达与胃癌淋巴转移均呈明显正相关（r=0.52、 0.52，P<0.05）。

2.4 VEGFC在不同病理分型胃癌中表达的差异

高、中、低分化胃癌组织中VEGFC mRNA表达水平分别为0.40±0.11、0.54±0.13、0.73±0.14。高、中、低分化组之间VEGFC mRNA表达水平差别有统计学意义（F=21.04,P<0.05）。低分化组VEGFC mRNA表达水平明显高于中、高分化组（q=4.60、9.01,P<0.05）；中分化组VEGFC mRNA表达水平高于高分化组（q=3.09,P<0.05）。

2.5 VEGFC在不同Borrmann分型胃癌组织中的表达

BorrmannⅠ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ型VEGFC mRNA的表达水平分别为0.16±0.07、0.29±0.11、0.71±0.11、0.81±0.12。4种分型之间VEGFC mRNA表达水平差别有显著意义（F=57.94，P<0.05）。Ⅰ型VEGFC mRNA表达水平明显低于Ⅲ、Ⅳ型（q=12.65、13.13，P<0.05）;而Ⅰ型与Ⅱ型VEGFC mRNA表达水平比较没有明显差异（q=2.87，P>0.05）；Ⅱ型VEGFC mRNA表达水平明显低于Ⅲ、Ⅳ型（q=13.23、13.13，P<0.05）；Ⅲ型和Ⅳ型VEGFC mRNA基因表达水平没有明显差异（q=2.67，P>0.05）。

3 讨 论

3.1 VEGFC与FLT4的分子生物学特征

VEGFC是VEGF家族成员之一，在多数肿瘤细胞中有表达，VEGFC基因位于人染色体4q34上[4]，编码一种含有419个氨基酸残基的蛋白质。VEGFC的前蛋白包括一个N端信号肽，其后为VEGF同源区和一个C端前肽， VEGFC前蛋白经蛋白酶水解后产生截短的成熟形式,从而