【摘要】 目的 观察胃癌组织及其癌变标本中基质金属蛋白酶(MMPs) 及其金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs) 基因表达的变化。方法 采用Northernblot、原位分子杂交ISH 的方法，对15例胃癌组织中MMP2、MMP9和TIMP1 基因的mRNA表达水平进行了检测。 结果 胃癌癌组织MMP2、MMP9 和TIMP1 的基因表达水平明显高于正常组织。它们在胃癌癌组织和间质细胞中均有分布。 结论 组织中MMPs 和TIMPs 的异常表达有助于胃癌的早期诊断。

【关键词】 基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制物；基因表达；胃癌

既往的研究表明，肿瘤的侵袭与转移，需要降解细胞外基质蛋白(extracellular matrix proteins，ECM)，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 是降解ECM 诸成分的关键酶〔1〕。基因表达、酶原激活和金属蛋白酶组织抑制物( tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs) 的抑制作用，是构成MMPs 活性的三个因素。MMPs 的基因表达异常及其ECM 的降解，与肿瘤细胞的侵袭和转移有关，TIMPs 可抑制这一性状。肿瘤细胞通过降解ECM 而发生侵袭、转移，与MMPs、TIMPs 的失衡有关〔2〕。在上述研究的基础上，本实验采用Northernblot、原位分子杂交ISH 的方法，对15例胃癌组织中MMP2、MMP9 和TIMP1 基因的mRNA表达水平进行了检测。

1 资料与方法

11 病例标本的选取和采集 15例液氮保存的胃癌手术切除标本，其中男9 例，女6 例，平均年龄558(48～69)岁；均有病理诊断。用作对照的8例正常胃组织取自意外死亡的正常人尸检标本。15 例胃癌病例中，导管细胞癌12 例，腺泡细胞癌1例，其他类型2 例。

12 探针的制备 所有cDNA探针均以质粒形式保存，在XL1blue 大肠杆菌中转化，以碱裂解法复制质粒 DNA。金属蛋白酶MMP2(pH3a)、MMP9(pHG1) 及其金属蛋白酶组织抑制物TIMP1(ATCC 59666) 质粒，由中国科学院长春应化所提供。多聚寡核苷酸引物由中国科学院长春应化所实验室用391 型DNA 合成仪(美国帕金埃尔默公司制造)制备。用〔α32P〕 dATP 进行延伸法PCR 标记〔3〕。

13 Northernblot 杂交采用异硫氰胍法提取总RNA，参考分子克隆实验指南〔4〕，进行Northern blotting 杂交分析。用VIDAS 图像处理仪对胶片上每个放射显影点定量灰度扫描，将各点的灰度值换算为可用参数，计算比较mRNA 表达量。胃癌组织和正常胃组织基因表达值以(MMPs、TIMP1/βactin)×100% 表示。

14 原位分子杂交 依据Boehringer Mannheim 公司提供的方法进行地高辛DNA 探针的标记〔5〕。阳性结果判断：根据阳性细胞所占肿瘤细胞的比例和显色强度分级，阳性信号为染色颗粒。阳性分级:阴性(-)，＜30%细胞显色；弱阳性(＋)，30%～80% 细胞显色，强阳性()，＞ 80%细胞显色。

15 统计学处理 样本间阳性率的比较采用χ2检验，例数较少的样本采用四格表精确概率计算法。

2 结果

21 MMP2、MMP9和TIMP1的基因表达水平 如表1所示。其趋势为MMP2≈MMP9＜TIMP1。

表1 MMPs 及其TIMPs 的基因表达值（略）

22 MMP2、MMP9 和TIMP1的基因表达阳性分布 在胃癌组织和间质细胞中均有分布；MMP2 在间质细胞中更多些，TIMP1 在胃癌组织和间质细胞中均匀分布，MMP9 则多分布于肿瘤细胞中(表2)。

表2 MMPs 及其TIMPs 的基因表达阳性分布（略）

3 讨论

肿瘤细胞通过结合位点与细胞外基质结合，分泌MMPs，溶解细胞外基质，进而经细胞外基质的缺损向外扩散；MMPs在肿瘤浸润、转移中的作用已为许多研究报道所证实。胃癌是浸润、转移能力很强的肿瘤，MMPs 在其进展中亦发挥了重要作用〔6〕。既往的研究表明：胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性较胃溃疡患者及慢性胃炎明显升高〔6〕。对胃癌MMPs 基因表达的研究也表明：胃癌明胶酶A基因表达较慢性胃炎显著增强，局部淋巴结发生转移者，明胶酶3基因表达较未转移者明显增强。TIMPs是MMPs的特异性抑制物TIMP1，它们在胃癌中的变化目前尚不清楚。本文结果表明：胃癌组织TIMP1 基因表达水平较慢性胃炎组织明显增强，这似乎提示在胃癌的发生、发展中随着MMPs 基因表达的增强、酶活性的升高，机体本身启动了抑制MMPs 的机制，增强TIMP1 的基因表达，抑制肿瘤的扩散。胃癌患者局部淋巴结未受累者TIMP1的基因表达水平明显高于局部淋巴结受累者，也正说明TIMP1有抑制癌转移的作用。TIMP1、MMPs在胃癌浸润、转移中的作用不同，MMPsTIMP平衡的失衡与否是决定胃癌转归的重要因素。胃癌TMP1 基因表达增强是否继发于MMPs 的基因表达，还是与MMPs 基因表达同时启动，或受细胞因子、生长因子的调控，有待于进一步研究。

【参考文献】
1 Mac Dougall JR, Matrisian LMContributions of tumor and stromal matrix metalloproteinases to tumor progression, invasion and metastasis〔J〕Cancer Metastasis Rev, 1995； 14 (4) :35162

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3 何 旭，李玉林，张丽红基质金属蛋白酶及其抑制剂在乳腺癌中的表达和意义〔J〕吉林大学学报(医学版)，2003；29(6)：7535
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6 Ding S, Chamberlain M, Mclaren A, et alCrosstalk between signaling pathways and the multidrug resistant protein MDR1〔J〕Br J Cancer, 2001；85(8): 117584