【关键词】 胃癌

【摘要】 目的 为了明确Hp在湖南地区胃癌中的感染情况及其在胃癌组织中的定位分布，探讨Hp感染在胃癌病因发病学中的可能作用。方法 采用PCR技术和Warthin-Starry（WS）染色方法检测我省胃癌中Hp的感染率，确定Hp在胃癌组织中的定位分布。并利用SPSS10.0软件分析Hp感染与胃癌临床病理特征的关系。结果 （1）PCR扩增幽门螺杆菌DNA ureA基因411bp片段，在109例胃癌中检测到42例Hp DNA阳性（阳性率38.53%），而WS有58例检出Hp菌体（阳性率53.21%），比PCR的检出率高（P<0.05）。（2）WS染色观察Hp存在于癌旁胃腔粘液、粘膜腺体内以及癌性腺体、粘液湖中，癌旁组织Hp阳性率高于癌灶部位（P<0.05）。（3）两种方法检测胃癌组织Hp阳性率与病人年龄、性别、肿瘤部位和淋巴结转移的差异无显著性（P>0.05），但与胃癌病理分期的差异有显著性（P<0.05），早期胃癌的Hp阳性率高于进展期胃癌。结论 Hp感染在胃粘膜癌变过程的较早期阶段可能有一定作用。

关键词 胃癌 幽门螺杆菌 聚合酶链反应 Warthin-Starry（WS）

Detection and location of Helicobacter pylori in human gastric carcinoma

Tang Yunlian，Gan Runliang，Xu Jinhua，et al.

Pathology Teaching Reseach Department，Nahua University，Hunan421001.

【Abstract】 Objective To define the infection of Hp and their localization in gastric carcinoma tissues，and to investigate their possible roles in the etiology of gastric carcinoma in Hunan province.Methods The incidence of Hp gastric carcinoma were estimated by polymerase chain reaction（PCR），Simultaneously，both tissues morphologic feaˉtures and the localization of Hp in gastric carcinomas were demonstrated by Warthin-Starry staining（WS）.In addiˉtion，the relationship between Hp infection and the clinico-pathologic factors of gastric carcinomas were analyzed with software SPSS10.0.Results （1）Hp was detected in39.03%
（42/109）and53.21%（58/109）of cases with gastric carcinomas by PCR and WS，respectively.Hp infection rate detected in gastric carcinomas by WS was higher than that by PCR（P<0.05）.（2）The result of WS indicated that Hp lied in the gastric antrum mucus，mucosal gland of normal tissues adjacent to cancer，and the gland，mucous pool of cancer tissues.The Hp positive rate of normal tissues adjacent to cancer was higher than that of cancer tissues（P<0.05）.（3）No significant difference in age，sex，site，type of tisˉsue samples and lymph node metastases was found between Hp-positive gastric carcinomas and Hp-negative cases by both methods（P>0.05），but Hp positive rate and clinical stage（early or advanced）of gastric carcinomas were sigˉnificantly correlated（P<0.05）.Conclusion These results suggest that Hp infection may play a certain role in the early stage of carcinogenesis of gastric mucosa epithelia.

Key words gastric carcinoma Helicobacter pylori polymerase chain reaction Warthin-Starry staining

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的病因发病机制至今尚未阐明，多数学者认为胃癌是一个多因素、多阶段、多步骤的发展过程。幽门螺杆菌（Hp）感染也是目前研究胃癌发病的因素之一 ^［1，2］ 。但Hp在胃癌中的定位分布及其如何参与癌的发生机制还不清楚，对Hp与胃癌病因发病学关系还需深入研究。为此，本课题利用PCR技术扩增109例胃癌组织中的Hp-ureA基因411bp片段，并采用（WS）银染观察Hp在胃癌中的检出率与定位分布情况;以了解Hp在我省本地区胃癌中的感染与定位分布情况，探讨Hp感染与胃癌临床病理特征的关系，为研究Hp与胃癌的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本的收集 来自本校附属第一医院32例胃癌手术标本（2000年10月～2002年3月），取肿瘤组织与癌旁正常粘膜，-70℃冻存;77例近3年胃癌组织石蜡包埋块。所有病例未接受放疗及化疗，均由附属第一医院病理科和本室作出诊断。

1.2 主要试剂与配制 引物由上海生工生物工程公司合成，酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），蛋白酶K，RNAse，DNAMarkˉer，Taq DNA聚合酶，dNTP购于上海生工生物工程公司。1×SSC（150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，pH7.0）;石蜡消化液（150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，1%SDS）。

1.3 PCR检测

1.3.1 DNA的提取 参考文献 ^［3］ 用常规酚-氯仿法提取对照细胞、组织及石蜡切片标本的DNA。取-70℃冻存的组织0.3～0.5g，生理盐水洗3遍，充分剪碎，加TNE400μl，20mg/ml的蛋白酶K30μl，55℃水浴中振摇过夜（12～24h）。

石蜡包埋组织块切6μm×20张，经二甲苯4次充分脱蜡，梯度酒精（100%，95%，75%，50%各30min）依次水化，1×SSC洗涤，干燥，加消化液400μl，20mg/ml的蛋白酶K20μl（使终浓度为1mg/ml），置55℃水浴摇床消化120h，消化至第四天时，加蛋白酶K10μl，间或振摇。

上述组织消化后，6000r/min离心2min，取上清液，加等量的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，pH8.0）抽提，沉淀用70%乙醇洗2遍，干燥，用含RNA酶（20μg/μl）的TE50～200μl，溶解DNA沉淀。紫外分光光度仪测OD值，OD260/OD280均在1.7～2.0，-20℃保存。

1.3.2 Hp-PCR扩增 参考文献 ^［4］ 设计引物序列，由上海生工生物工程公司合成。引物序列为P ₁ 5′-GCC AAT GGT AAA TTA GTT-3′，P ₂ 5′-CTC CTT AAT TGT TTT TAC-3′。所设计的引物序列位于ureA基因组，扩增片段长度为411bp，PCR扩增体系为25μl，各反应成分浓度为模板DNA0.25μg，dNTP各200μmol/L，引物各为0.2μmol/L，MgCl ₂ 1.5mmol/L，PCR缓冲液2.5μl，Taq酶1.25U。以Hp NCTC11637幽门螺杆菌的标准菌株DNA为阳性对照，以TE作为阴性对照。按下列条件扩增:94℃预变性5min，94℃1min，47℃1min，72℃1min共35个循环，72℃延伸10min。从PCR产物中取10μl经1.5%的琼脂糖凝胶、120V电泳30min后于紫外透射仪上观察，若在411bp处出现与阳性对照一致的橙黄色条带，则为Hp-DNA阳性。

1.3.3 WS染色 （1）试剂配制:①0.2mol/L的醋酸缓冲液（pH3.6）:A液925ml（醋酸12ml，蒸馏水加至1000ml）;B液75ml（无水醋酸钠1.64g，加蒸馏水至100ml）。②1%硝酸银液:硝酸银1g，0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.6）100ml。③2%硝酸银液:硝酸银0.2g，0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.6）10ml。④5%明胶液:明胶5g，0.2mol/L醋酸缓冲液96ml。此液需要加温35℃～40℃，不断摇动使之溶解，冷却后使用。⑤3%对苯二酚液:对苯二酚0.3g，0.2mol/L醋酸缓冲液10ml。⑥显影液:明胶:2%硝酸银液:3%对苯二酚按15∶3∶1混匀。（2）染色步骤:①胃癌组织的石蜡包埋块，连续切片4μm厚，粘贴于载玻片上，切片标本经常规脱蜡至水化。②0.2mol/L的醋酸缓冲液洗两遍。③置1%硝酸银中避光，56℃孵育1h。④直接把切片取出，立即浸入显影液内染色3～8min。⑤切片浸入56℃蒸馏水中洗1～2min。⑥蒸馏水洗1次。⑦无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封固。结果判断:胃幽门螺杆菌呈棕黄色或黑色，背景呈淡黄色。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。

2 结果

2.1 PCR扩增ureA基因411bp片段 共有42例出现EBV-DNA阳性条带，阳性率为38.5%。阳性对照及阳性标本在411bp处出现阳性单一的橙黄色条带，阴性对照及阴性标本无扩增条带，PCR扩增产物均经1.5%琼脂糖电泳鉴定（如图1所示）。32例胃癌冰冻组织中有17例阳性（阳性率53.13%），77例胃癌石蜡切片25例阳性（阳性率32.47%），0.01

2.2 WS染色结果 WS染色结果表明，在109例胃癌中检测到58例（阳性率53.21%）有Hp菌体，比PCR检出率高。同时观察到Hp的形态和分布（图2～5），不同大小的Hp呈弯曲、S形、弧形或杆状的不同形态，细菌在非肿瘤组织部位多集中，呈鱼贯状排列;在肿瘤组织部位，呈弥散状。在这58例胃癌中，我们观察到Hp存在于癌旁组织的粘液、腺体及腺上皮细胞胞浆内有25例（癌旁组织为癌灶周围的非肿瘤组织部位，与癌灶部位为同一石蜡切片），存在癌灶部位的（包括癌细胞胞浆、癌性腺体及粘液湖）有3例，Hp同时存在于肿瘤部位和非肿瘤部位有30例（表1），经χ ² 检验（χ ² =15.750，P<0.005），非肿瘤部位Hp阳性率高于肿瘤部位。

图1 Hp-PCR411bp产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳结果（略）

表1 Hp的阳性率与不同组织部位的比较（略）

图2 Hp存在癌灶、癌细胞胞浆内（略）