【摘要】 目的 了解Eselectin、Integrin β1、ICAM1在人胃癌细胞中的表达水平，探讨胃癌细胞、正常胃上皮细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附力学特性及其黏附分子的作用机制。方法 采用Northern印迹法和ELISA法检测胃癌细胞、正常胃上皮细胞和人脐静脉内皮细胞Eselectin、Integrin β1及ICAM1表达水平；采用微管吸吮技术分别测量了胃癌细胞、正常胃上皮细胞与人脐静脉内皮细胞间的黏附特性，利用抗体阻断实验验证胃腺癌细胞与人脐静脉内皮细胞黏附行为中Eselectin、Integrin β1及ICAM1的作用。结果 胃癌细胞、正常胃上皮细胞和人脐静脉内皮细胞均有Eselectin、Integrin β1及ICAM1表达，但胃癌细胞3种黏附分子表达水平均高于正常胃上皮细胞和人脐静脉内皮细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附力值为(31±4)×10-10 N，较之正常胃上皮细胞黏附力明显升高［(20±3)×10-10 N］，两者差异有统计学意义(P＜0.001)。抗体阻断前后细胞之间的黏附力比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 Eselectin、Integrin β1及ICAM1可能与胃癌细胞转移有关。

【关键词】 胃肿瘤； 细胞黏附分子； 黏附力； 微管吸吮技术

Expressions of Eselectin, Integrin β1 and ICAM1 in gastric cancer and adhesive properties of gastric cancer cells to umbilical vein endothelial cells LENG Zhongbin*, SHAO Qinshu, LI Shuguang.*First Tongxiang People′s Hospital of Zhejiang, Tongxiang 314500, China

Corresponding author: SHAO Qinshu, Department of General Surgery, People′s Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310014, Email: mingfen8@hzcnc.com

【Abstract】 Objective To understand expressions of Eselectin, Integrin β1 and ICAM1 in gastric cancer and investigate the adhesive mechanics of gastric cancer cells and normal stomach epithelium to umbilical vein endothelial cells as well as the mechanism of adhesive molecules. Methods Nothern Blotting hybridization and ELISA were used to detect expressions of Eselectin, Integrin β1 and ICAM1 in gastric cancer cells, normal stomach epithelium and umbilical vein endothelial cells. In the meantime, the adhesive properties of gastric cancer cells and normal stomach epithelium with umbilical vein endothelial cells were observed by using technique of micropipet aspiration. Then, the roles of Eselectin, Integrin β1 and ICAM1 in adhesiveness of gastric cancer cells with umbilical vein endothelial cells were proved by antibody blockage experiment. Results In gastric cancer cells, normal stomach epithelium and umbilical vein endothelial cells were found expressions of Eselectin, Integrin β1 and ICAM1, which were higher in gastric cancer cells than those in normal stomach epithelium and umbilical vein endothelial cells, with statistically significant difference (P<0.05). The adhesive forces of gastric cancer cells and normal stomach epithelium to umbilical vein endothelial cells were (31±4)×10-10 N and (20±3)×10-10 N respectively, with statis tically significant difference between two groups (P<0.001). There was statistical difference upon adhesive forces of gastric cancer cells to umbilical vein endothelial cells before and after blockage (P<0.05). Conclusion Eselectin, Integrin β1 and ICAM1 may be related to tumor metastasis.

【Key words】 Gastric tumors; Cell adhesive molecules; Adhesion; Micropipette aspiration

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率占全部恶性肿瘤的10%，而肿瘤转移是致死的主要原因。恶性肿瘤的浸润与转移存在着多环节、多步骤复杂的分子机制，其中肿瘤与内皮细胞的黏附是肿瘤转移的决定性步骤之一。本研究以Eselectin、Integrin β1及ICAM1黏附分子在胃癌细胞表达及其受体配体的相互作用为研究重点，进一步在分子水平上探讨肿瘤细胞的黏附力学行为与恶性肿瘤浸润性生长过程的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K(20 mg/ml)、tRNA(10 mg/ml)购自美国Promega公司。试剂盒购于德国Boehringer Mannhheim公司。RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，完全培养基含10%的小牛血清、0.03%的谷胺酰胺、100单位/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。多聚赖氨酸(PolyDlysine,PDL)购自美国Sigma公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Gibco公司。Matrigel购自美国Collaborative Res公司。耗材、微针、chamber、录像带、灌针液等显微操作系统材料购自德国宝灵曼公司。Eselectin、Integrin β1及ICAM1 单克隆抗体购自美国R&D公司。其余试剂均为国产AR级。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分离、培养及样品的制备：人胃癌细胞系MKN45用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，每周换液2次。正常胃上皮细胞的原代培养，取胃溃疡手术标本远端非病变区黏膜，用Hanks液漂洗后剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，于Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶中消化80 min。收集细胞悬液，800 r/min离心10 min，沉淀用Hanks液漂洗两次。用含1%～2%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种入不同孔数的培养板中。人脐静脉内皮细胞的原代培养，取产后的新鲜脐带，无菌剪取长10～15 cm，用三通注射器吸温PBS液注入脐带的脐静脉中，洗除残血。注入口处用线绳结扎。用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的胶原酶，结扎两端使胶原酶充满血管，消化3～10 min。收集细胞悬液，800 r/min离心10 min，沉淀用Hanks液漂洗两次。用1640培养液悬浮细胞，接种入瓶皿中培养。

1.2.2 总RNA的制备：收集对数生长期细胞，用Trizol按试剂盒说明书提取细胞总RNA。吸光度<260 nm处测定RNA量，-70 ℃贮存备用。

1.2.3 探针的制备： Eselectin、Integrin β1及ICAM1重组质粒(美国匹兹堡大学俞自仁博士惠赠)按常规扩增。用碱裂解法提取质粒DNA(cDNA)，以PCR扩增cDNA探针。

1.2.4 Northern印迹：cDNA探针的放射性同位素标记按照Promega公司提供的标准程序进行。Nothern印迹杂交重复3次。

1.2.5 ELISA法检测：Eselectin、Integrin β1及ICAM1含量用1个固相ELASA试剂盒检测，按试剂盒说明书操作。检测敏感性分别是Eselectin：1 ng/ml；Integrin β1：2 ng/ml；ICAM1：0.3 ng/ml。

1.2.6 胃癌细胞、正常胃上皮细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附力测定：血管内皮细胞以约1×106/ml的浓度接种于预先经PDL裱衬的圆形小室的玻璃表面。用RPMI 1640完全培养基常规培养，2～3 d形成融合单层。弃去培养液，以Hanks液清洗1～2次，分别加入浓度约1×105/ml的胃癌细胞和正常胃上皮细胞。抗体阻断试验，分别加入Eselectin、Integrin β1及ICAM1 单克隆抗体，最终浓度达20 μg/ml。37 ℃静置60 min后采用微管吸吮技术对细胞的黏附力进行实验测试：分别吸取(4～5)×104个胃癌细胞、正常胃上皮细胞悬液加入圆形小室中，置于37 ℃温育20 min后，轻轻吸出细胞悬浮液以去掉未黏附细胞，重新加入RPMI 1640培养液，于显微镜下确定待实验的细胞后，在显微操作视野下将微管尖端(内经约5～6 μm)靠近细胞表面，初压为零，通过压力控制系统逐步加大负压直至细胞与相应血管内皮细胞表面分离，记录该临界负压值。实验所测细胞黏附力(F)计算公式为：

F=πR2·ΔP·Cosθ

其中，π为圆周率，R为微管尖端内半径(在图像处理系统上测出，本实验微管内半径在2.5～3.5 mm之间)，ΔP为细胞黏附分离的临界负压值，θ为微管与平面夹角，约10°左右，这样Cosθ=Cos10°≈0.985≈1，因此数据处理时直接以1计算，则F=πR2·ΔP。

1.3 统计学分析

应用SPSS 10.0统计软件包，所有数据以±s表示，进行两样本均值的t检验。Northern印迹的结果在Pharmacia LKB Ultroscan XL激光光度计上于633 nm波长下作灰度扫描， 以其吸收峰的积分值作为mRNA含量的参数， Northern印迹杂交重复3次。

2 结果

2.1 Nothern印迹结果(图1)

1：Eselectin和正常胃上皮细胞； 2：Integrin β1和胃癌细胞； 3：CAM1和胃癌细胞； 4：Eselectin和人脐静脉内皮细胞； 5：Eselectin和胃癌细胞)

图1 胃癌细胞、正常胃上皮细胞和人脐静脉内皮细胞上的Eselectin、Integrin β1和ICAM1<