【摘要】 目的 探讨人胃癌细胞活性经过端粒酶RNA干涉后基因片段的差异表达以及对其进行克隆和测序。方法 通过荧光差异显示获得DNA，经过PCR扩增、DNA克隆，对制备的质粒DNA酶切产物进行鉴定及序列分析。 结果 以端粒酶RNA干涉的真核细胞表达载体转染两种胃癌细胞系，均检测到一些基因的表达发生改变；对其中4个片段进行了测序，有2个是癌发生相关基因。 结论 RNA干涉后人胃癌细胞基因发生变化，活性下降，RNA干涉可用于肿瘤基因治疗。

【关键词】 端粒酶；RNA干涉；荧光差异显示

人体正常细胞中端粒酶是关闭的，但在85％的人肿瘤细胞中都已发现了端粒酶活性的表达。大量的研究表明，端粒酶的活性与多种肿瘤的形成有关〔1〕。RNA干涉是由与特定基因同源互补的双链RNA在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解，从而导致转录后基因沉默的过程〔2〕。以往多采用构建核酶的方法来抑制端粒酶活性，因方法比较复杂，临床广泛应用带来障碍。而由于RNA干涉的持续性好等特点，其已成为最主要的应用方法。本文旨在了解端粒酶活性抑制后基因表达的变化情况，为肿瘤的抑制及治疗提供理论可能。

1 材料与方法

11 材料 质粒pCDNA31、大肠杆菌Escherichia coli DH5 α为江苏大学生命科学研究院保存。MGC803、BGC823细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基为Sigma产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，Lipofection为GIBCOBRL公司产品。

12 方法

121 引物设计和合成 根据RNAi原理，在Ambion网站设计了用于干涉的DNA片段。以端粒酶(基因序列号AF015950)的读码框序列19个碱基(18211839 bp)为靶点，前导序列P1：5′AGC TTC AGA CAG CAC TTG AAG AGT TCA AGA GAC TCT TCA AGT GCT GTC TGA AG3′，后续引物P2：5′AAT TCT TCA GAC AGC ACT TGA AGA GTC TCT TGA ACT CTT CAA GTG CTG ACT GA3′，中间含9 nt的spacer区为发夹结构的环区，引物两段含Hind III和EcoR I的黏性末端以便于克隆进载体。

122 pCDNA31P12表达载体的构建 引物P1、P2各5 μl混和均匀，95℃，5 min变性后，室温下自然冷却退火。P1、P2碱基配对，形成EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切位点。该片段与用EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切的质粒pCDNA31(摩尔比1:1～1:3)用T4 DNA Ligase连接过夜。质粒酶切电泳初步筛选阳性克隆。对鉴定正确的pCDNA31P12质粒进行柱抽。方法见上海华舜生物技术有限公司柱抽试剂盒说明书。

123 细胞培养 胃癌细胞系MGC803和BGC823细胞购自中国细胞保藏库。细胞用DMEM培养基(含10％胎牛血清)在37℃下培养(5％CO2)。以血球计数板测得细胞数达5×105时备用。

124 脂质体介导的基因转染 准备质粒DNA/脂质体复合物，溶液A：分别取质粒(5～10 μg)，加入无血清DMEM培养基补充体积至100 μl；溶液B：取脂质体8 μl,加入92 μl无血清DMEM培养基。将溶液A和溶液B混匀，室温静置15 min。将6孔板中的MGC803和BGC823细胞以无血清DMEM培养基洗2～3次，加入800 μl无血清的DMEM培养基后，再加入准备好的质粒DNA/脂质体复合物200 μl。37℃,5％CO2继续培养2 h，加1 ml含有20%血清的DMEM继续培养。同时对作为对照的pCDNA31DNA以同样的方法进行转染。

125 RNA提取及cDNA合成 细胞培养48 h后，每孔加1 ml Trizol，按照试剂使用说明书提取RNA。提取的RNA 1 μg采用SuperscriptⅡ进行逆转录，合成cDNA。

126 荧光差异显示 对合成cDNA的进行PCR扩增。反应体系为20 μl：10×PCR buffer 20 μl，dNTP mix(10mM)16 μl，HAP primer(2 μM)20 μl，FHT11M primer 20 μl，RTmix 20 μl，Taq DNA polymerase(QIAGENE)02 μl，ddH2O 102 μl。反应条件为：94℃ 30 s、40℃ 2 min、 72℃ 1 min，40个循环后再在72℃下延伸 5 min。取6 μl反应液上样到6％的聚丙稀酰胺凝胶中，1500V电压下电泳5 h,在HITACH激光扫描仪中检测。

2 结果

21 pCDNA31P12载体的构建 根据RNA干涉的原理，设计和合成了针对端粒酶的RNA序列。这对序列经退火后与真核表达载体pCDNA31连接。由于外源片段较小，难以通过酶切直接鉴定外源片段的产生。pCDNA31质粒能被EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、BamHⅠ等酶切，而一旦插入了外源片段，则不能被KpnⅠ、BamHⅠ等酶切成线性，但能被HindⅢ和EcoRⅠ酶切(图1)。图2所示3号为重组质粒。进一步通过测序表明，该片段以正确的方向克隆进表达载体中。

图1 构建端粒酶RNA干涉的重组质粒（略）

图2 端粒酶RNA干涉的重组质粒的酶切鉴定结果（略）

22 荧光差异显示 通过荧光差异检测，发现在两株细胞系中，随着对端粒酶表达的干涉，均造成了其他基因表达的下降(图3)。

23 差异片段的克隆和测序 从胶中挖出差异片段，经过二次PCR后，将扩增的片段克隆进T载体，再经酶切鉴定后测序。其中有两个序列是肿瘤相关基因，其一个序列为：TTTCTCAACATCAACTGGGAGCTTGTTAATACAGTGTCTCCAATCCAGCCCAGAACCTACAGAATCAGCCTGCATTTTAACGCCCATCTCCTGGTGATTCATATGGCCATTGTAATTTGAGAAGCATTTGTCTAGTAGTCACAGTGCAGGGGGCCTGAGATAAGGTGCAGGTGTCTATCGCTGTAGTAAAGGTGAGGAACTGAAGCAAGATTCATGAAGT
ACACAAGATTCTGAACTCAGCCCATCATTTGAGGTAACTTCACCCTTTACCATCTGTGTGAATTGTAATCTCTAGA；另一个序列为：ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAAAATTAAAGAGGGCTTGTTATAATTTTGACTACTATTCTTAATCAATGGAGTACATGG
ATATAAAATAGTTATAAAAAGGCACCCAATAAATGTTTTGTTGACTTGAAAAGAATTTATTTTGGAAAACTTAAAAGCCAAGTTTAAT
TCCATGGGGAAAGGAAAAAATGGATTTTCCAACATAACCCTGAAATTTAGCCCATATTCATCATAAACATTCATTACAATACACCA
AAAAGGGACCAAATTATATAATATGCAAAAGACCAAAAATTATACATCTAAATTACTTAAAACATTAACACTCAAGATGCAAACAC
ACCCTTTACCATCCTGTGTGAAATTGT。

A图：1BGC823细胞pCDNA31P12转染；2BGC823细胞pCDNA31转染(对照)；3MGC803细胞pCDNA31P12转染；4MGC803细胞pCDNA31转染(对照)。B图：从左第1道起依次为MGC803细胞pCDNA31转染(对照)；MGC803细胞pCDNA31P12转染；BGC823细胞pCDNA31转染(对照)；BGC823细胞pCDNA31P12转染，采用两种引物，共8个泳道。

图3 荧光差异显示法检测端粒酶RNA干涉后胃癌细胞系基因的表达（略）

3 讨论

近年来，很多关于抑制端粒酶活性的研究相继报道，包括多种反义核酸修饰物：肽核酸、腺核酸、核酶〔3〕和RNA干涉〔4〕等均有较强的生物学活性。因RNA 干涉的持续性好是一项快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技术，它可以象基因敲除一样非常有效地鉴定特定基因的功能等特点，其已成为最主要的应用方法。据此设计出dsRNA就可以使该基因沉默,是研究疾病机理和鉴定候选药靶的关键步骤，为可控地打开或者关闭某一特定基因这一目标奠定了基础〔5〕。

RNA干涉也为疾病的治疗开辟了新的途径。本研究中成功地构建了用于端粒酶RNA干涉的真核细胞表达载体，实验发现以端粒酶RNA干涉的真核细胞表达载体转染两种胃癌细胞系，均检测到一些基因的表达发生改变，两种胃癌细胞的端粒酶活性被显著抑制，说明RNA干涉是通过与端粒酶基因序列特异性结合，调控端粒酶基因的。进一步对这些差异表达的片段进行克隆和测序，进行GenBank同源序列的比较，结果发现有2个是癌发生相关基因，但抑癌基因p53、bcl2及致癌基因cmyc等基因不受影响，提示这3个基因与与端粒酶的活性没有直接关系，这也说明仅通过控制端粒酶活性来抑制和治疗肿瘤不一定会获得理想的效果〔6〕。

当端粒酶活性被抑制后，少数肿瘤细胞可以启动或激活其他种系特异性的信号传导通路，重新合成端粒重复序列，维持有效端粒长度，继续增殖〔7〕。在表达改变的基因中，有5个条带扩增出了片段，PCR产物与T载体连接的酶切鉴定，共获得9个阳性克隆，已对其中4个片段进行了测序。在与基因库序列比较同源性时，发现有两个序列分别与已公布的肿瘤相关基因的同源性很高(基因的序列号分别为AC089983和CK570336)，达90％以上，可能是肿瘤相关基因，另有两个基因是未知基因，有待进一步研究。

【参考文献】
1 Harley CB，Futcher AB，Grider CW Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts〔J〕 Nature， 1990； 345:45860

2 Zhu XL，Kumar R，Mandal M，et al Cell cycledependent modulation of telomerase activity in tumor cells〔J〕 Proc Natl Acad Sci USA，1996； 93:60915

3 Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer〔J〕 Science， 1994； 266:20115

4 NAtarajan S，Chen Z，Wancewicz EV，et al Telomerase reverse transcriptase(hTERT) mRNA and telomerase RNA(hTR) as targets for downregulatio