【摘要】目的探讨女贞子等中药促毛囊生长的机制。方法我们应用RT－PCR技术和凝胶密度扫描分析技术，对正常生长周期中毛囊肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA表达水平，以及女贞子等中药对体外培养小鼠触须毛囊HGF和VEGFmRNA表达水平的影响进行了深入的研究。结果我们的研究发现正常毛囊生长周期中，生长期毛囊有明显的HGF和VEGFmRNA表达，而退行/休止期毛囊则很难检测出上述因子mRNA的表达。在毛囊生长发育的过程中，HGF和VEGFmRNA表达也逐渐减弱。与女贞子混合培养的毛囊，在培养的第6天仍有相当量的HGF和VEGFmRNA表达，而相应的对照组则未能测到这些因子的表达。而与齐敦果酸培养的毛囊在培养的第6天仅有HGFmRNA表达，而无VEGFmRNA的表达。结论女贞子及齐敦果酸可促进体外培养的毛囊对HGF和(或)VEGFmRNA的表达。从而从分子生物学水平揭示了上述药物促进毛囊生长的可能机制。

Expression of Growth Factor mRNA in Hair Follicles Cultured with Some Chinese Herbs

FAN WeixinZHUWenyuan.

（Department of Dermatology. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029）

【 Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of hair growth stimulated by some Chinese herbs. Methods Expression of hepatocyte growth factor (HGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA was detected by RT－PCR in normal hair cycles and in hair follicles cultured with some Chinese herbs. Results Expression of HGF and VEGF mRNA varied in normal mouse vibrissa follicles during hair growth cycles. HGF and VEGF mRNA were detectable in anagen follicles, but not in catagen/telogen follicles. The expression of HGF and VEGF mRNA decreased gradually in the follicles from very early anagen to late anagen. At the sixth day the expression of HGF and VEGF mRNA was still detectable for the group in which the follicles were cultured with Ligustrum lucidum(A), but not for control group. At the sixth day HGF mRNA expressed only when the follicles cultured with olianolic acid, an active ingredient of Ligustrum lucidum. Conclusion The results demonstrate that there is varying expression of HGF and VEGF mRNA in the hair growth cycles of mouse vibrissa follicles.Ligustrum lucidum (A) is shown to up regulate the expression of HGF and VEGF in mouse vibrissa follicles culture model.

【 Key words】 Hair follicles Hepatocyte growth factor Endothelial growth factor Fructus ligustri lucidi

肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)是新近发现于毛乳头的两个生长因 子。他们是由生长期毛囊的毛乳头分泌，并对毛发生长有明显的促进作用^[1,2]。为了解 它们在整个毛囊生长周期中的动力学改变，我们通过RT－PCR和半定量RT－PCR技术，对 生长周期不同阶段毛囊HGF和VEGF的

mRNA表达水平进行动态观察，发现在生长周期的不同阶段，毛囊HGF和VEGF的mRNA表达 水平有明显变化。我们还研究了某些促毛发生长药物与毛囊HGF和VEGFmRNA表达的关系。现将研究结果报道如下。

材料和方法

一、实验动物

小鼠触须毛囊取自出生35～65d近交系C57BL/6J小鼠，雄鼠24只，雌鼠29只。具体培养方法 同文献^[3]。

二、毛囊生长周期中VEGF和HGFmRNA表达的研究

1.实验分组:实验分6组，每组20个毛囊,分组依据同文献^[4]。他们分别是①生长期－Ⅰ毛 囊；②生长期－Ⅱ毛囊；③生长期－Ⅲ毛囊；④生长期－Ⅳ毛囊；⑤退行期/休止期毛囊；⑥阴性 对照组（毛囊间结缔组织）。

2.总RNA提取：分离的毛囊立即放入1mLTrizol（购于生命技术公司）中，总RNA提取严格 按照试剂盒说明步骤进行^[5]。

3.RT－PCR：采用一步法RT－PCR放大系统（AccessRT－PCRSystem）试剂盒（购于Promega公 司）。特异性针对小鼠VEGFmRNA的一对引物的序列分别为5'－ CAGGCTGCTGTAACGATGAA－3'和5'－AATGCTTTCTCCGCTCTGAA－3'。扩增产物为207bp^[6]。特异性针对小鼠HGFmRNA的一对引物序列为5'－CCATGAATTTGACCTCTATG－3'和5'－ ACTGAGGAATGTCACAGACT－3'，扩增产物为278bp^[7]。RT－PCR在PERKINELMER2400上完成。详细 步骤见Schroppel等^[6]和Yang等^[7]的研究。RT－PCR产物在质量分数为2％琼脂糖凝胶上电泳 ，溴乙啶染色。凝胶扫描，图象打印。

4.内参照:研究中设立阴性对照，为保证实验的准确性，反应体系中还加入针对小鼠β－ 肌动蛋白mRNA的特异性引物作为内参照来证实标本中mRNA已被完整的提出，同时还可 作为半定量RT－PCR的内参照物。

5.RT－PCR反应产物的定量：RT－PCR扩增后的产物经质量分数为2％琼脂糖凝胶电泳后， 溴乙啶染色，紫外线下对凝胶进行密度扫描，从而得出各阳性条带的绝对密度。该工作 在美国基因公司生产的密度扫描仪上进行。

三、中药及其单体对体外培养小鼠触须毛囊中VEGF和HGFmRNA表达水平的研究

女贞子、黄芪和白芷的培养质量浓度为2.5mg/mL，齐敦果酸培养质量浓度为130μg/mL。 阴性对照组为单纯毛囊培养。每组20个毛囊，分别培养2d、4d和（或）6d。毛囊分离、 总mRNA提取、RT－PCR、电泳、溴乙啶染色、凝胶扫描定量等同前。

结果

一、毛囊生长周期中不同阶段VEGF的mRNA表达

小鼠触须毛囊各生长周期VEGF的mRNA表达（见图1）。所有标本均有β－肌动蛋白特异 性mRNA表达（图1中500bp的条带）。证实各样本中的mRNA已成功提取出，RT－PCR系统 工作正常。生长期各个阶段的毛囊都有VEGF的mRNA表达（链A,B,C,D），而在退行期/休 止期毛囊则未检测到VEGF的mRNA表达（链E）。毛囊间结缔组织中未检测到VEGFmRNA的 表达（链F）。生长期毛囊在其生长发育并不断成熟的过程中VEGF的mRNA表达也逐渐减 少。凝胶密度扫描定量分析结果显示VEGF/β－肌动蛋白的密度比值生长期－Ⅰ为 0.2442，生长期－Ⅱ为0.2323，生长期－Ⅲ为0.1956，生长期－Ⅳ为0.1622，退行期/休止期为 0.0727，阴性对照为0.0571。各组之间差异均有显著性（P＜0.05）。而在退行期/休止期毛囊 与阴性对照之间差异无显著性（P＞0.05）。

二、毛囊生长周期中不同阶段HGF的mRNA表达

所有标本均有β－肌动蛋白特异性mRNA表达。毛囊生长期各阶段都有HGF278bp的 mRNA表达。但生长期－Ⅰ和生长期－ⅡHGF的mRNA表达较明显（链A,B），此后随毛囊 进入生长期－Ⅲ和生长期－Ⅳ，mRNA表达逐渐减弱（链C,D），到退行期/休止期未能检 测到HGF的mRNA表达（链E）。毛囊间结缔组织中未检测到HGFmRNA的表达（链F）。凝 胶密度扫描定量分析结果，HGF/β－肌动蛋白的密度比值生长期－Ⅰ为0.4095，生长期－ Ⅱ为0.4177，生长期－Ⅲ为0.2793，生长期－Ⅳ为0.2303，退行期/休止期为0.0923，阴性对照 为0.0614。除生长期－Ⅰ与生长期－Ⅱ之间差异无显著性（P＞0.05）外，各组之间差异均 有显著性（P＜0.05）。

三、女贞子对体外培养小鼠触须毛囊VEGFmRNA表达的影响

各标本中都有β－肌动蛋白mRNA的表达。培养的第2天，女贞子组与对照组间VEGF mRNA的表达无明显差异，但培养的第4天，女贞子组VEGFmRNA的表达明显强于对照组（ 链C与D），培养的第6天女贞子组仍然有相当的VEGFmRNA表达（链E），而对照组VEGF mRNA的表达却非常微弱（链F）。毛囊间结缔组织VEGFmRNA表达为阴性（链G）。RT－ PCR产物电泳结果的凝胶密度扫描定量分析结果也显示培养的第2、4、6天，VEGF/β－肌动 蛋白的密度比值在女贞子组分别为0.4595、0.4466和0.1880，显著高于相应的对照组（P＜ 0.01）。

图1毛囊各生长周期血管内皮细胞生长因子mRNA表达RT－PCR电泳结果

四、黄芪、白芷和齐敦果酸对体外培养小鼠触须毛囊VEGFmRNA表达影响

培养的第2天，各组都有207bp的VEGFmRNA表达，与阴性对照之间无明显差异。培养第 6天，各组与对照组一样，都未检测到VEGFmRNA表达。各标本中都有500bpβ－肌动蛋白 mRNA表达。

五、中药及其单体对体外培养小鼠触须毛囊HGFmRNA表达的影响

各组毛囊标本均可见β－肌动蛋白特异性mRNA表达。培养第2天，与女贞子、黄芪、白 芷、齐敦果酸培养的毛囊和单纯培养的毛囊（阴性对照组）均有明显的278bpHGF mRNA表达（链A,C,E,G,I）。但培养到第6天，女贞子组、齐敦果酸组仍有一定量的HGF mRNA表达（链B,H），而黄芪、白芷和对照组则未能检测到HGFmRNA的表达（链D,F,J） 。RT－PCR产物电泳结果的凝胶密度扫描定量分析显示<