【摘要】目的观察蛋白激酶A信号途径对8－甲氧补骨脂素(8－MOP)诱导的鼠黑素瘤细胞黑素生成及酪氨酸酶基因表达水平的影响。方法用半定量逆转录聚合酶链反应技术检测腺苷酸环化酶特异性激活剂毛喉素对8－MOP诱导的鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素含量以及酪氨酸酶基因表达水平的影响。结果毛喉素与8－MOP联合处理组所测的酪氨酸酶活性和黑素含量与空白对照组相比提高近7或10倍。毛喉素与8－MOP单独处理组较空白对照组酪氨酸酶mRNA表达水平上调百分率分别为26.06％和6.58％，而联合处理组上调百分率为56.82％。结论毛喉素在体外对8－MOP诱导的黑素生成呈明显增强作用，这一作用与毛喉素在转录水平上调酪氨酸酶mRNA表达促进酶蛋白合成有关。毛喉素作为治疗白癜风的一种信号转导药物，其临床应用价值有待今后进一步研究。

Regulation of 8－ methoxypsoralen－ induced Tyrosinase mRNA Expression by Forskolin in B16F10 Murine Melanoma Cells

LEI Tiechi，ZHU Wenyuan，XIA Mingyu.

（Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029）

【Abstract】 Objective To explore the regulatory mechanism of tyrosinase activity by cAMP/PKA dependent signaling pathway. Methods The regulatory effects on tyrosinase mRNA level were assessed by forskolin, a specific activator of adenylate cyclase in cultured B16F10 murine melanoma cells by using RT－ PCR technique. Results It was shown that forskolin could significantly enhance tyrosinase activity, melanin content, and tyrosinase mRNA level. Tyrosinase activity and melanin content were as much as seven to ten－ fold higher in cells exposed simultaneously to forskolin and 8－ MOP than those in untreated cells. The levels of tyrosinase mRNA were up－ regulated by 26.06％ with 8－ MOP, 6.58％ with forskolin, and 56.82％ with 8－ MOP plus forskolin, respectively. Conclusion Forskolin is shown to enhance 8－ MOP－induced tyrosinase activity, probably by way of up－ regulation of tyrosinase mRNA expression and tyrosinase synthesis. Further study is needed to understand the therapeutic significance of forskolin for vitiligo.

【Key words】 Monophenol monooxygenase Cyclic AMP－ dependent protein kinases Gene expression Methoxsalen

我们最近的研究发现8－甲氧补骨脂素(8－MOP)在体外能以剂量依赖方式提高鼠黑素瘤细 胞的酪氨酸酶活性和黑素含量,直接诱导黑素细胞的黑素生成，同时还发现蛋白激酶 A(PKA)信号转导途径参与调节这一过程^[1]。我们用腺苷酸环化酶特异性激活剂毛喉素 (forskolin)上调细胞内cAMP水平，活化PKA信号途径，并与8－MOP在体外单独或联合处理培 养的B16F10鼠黑素瘤细胞，并用半定量逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)技术同时检测酪氨 酸酶活性、黑素含量以及酪氨酸酶基因表达水平。旨在弄清PKA信号途径对8－MOP诱导 黑素生成调节的分子机制，为信号转导药物的临床应用提供依据。

材料和方法

1.主要试剂和材料:毛喉素（Sigma），8－MOP（江苏溧阳市制药厂提供），TRIzol试剂盒（ GibcoBRL,批号:1012613），AccessRT－PCRsystem试剂盒(Promega,批号：92627)，pGEMDNA标记(Promega),焦碳酸二乙酯（DEPC）(Fluka进口分装)，琼脂糖 (电泳级，BRL,USA)。其余有关材料及试剂均为进口或国产分析纯产品。PerkinElmerCetus 2400热循环仪(美国PE公司)，White/UltravioletTransilluminator凝胶扫描仪（美国Gene公司，南京医 科大学儿科研究所）。

2．细胞培养：取指数生长期的B16F10细胞，待生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶和 0.02％EDTA消化，用含有10％新生牛血清(NCS)，10mmol/LHEPES和2mmol/L左旋谷氨酰胺的Eagle′sMEM培养液传代，置CO2孵箱37℃，5％CO2，饱 和湿度环境常规进行培养。每一次实验均取自同一传代细胞，根据实验设计要求和培养 瓶规格选定细胞初始接种浓度为5000个/cm2左右。细胞接种24h后，用添加药物的新鲜培 养基换液1次。继续孵育72h。加药处理后3、12、24、48、72h在倒置显微镜下观察细胞形 态学变化并摄像记录。收获细胞台盼蓝排斥法计数活细胞数，将细胞分为两份用于酪氨 酸酶活性、黑素含量测定以及酪氨酸酶基因表达水平测定。

图1传代培养的B16F10细胞主要为两极，偶见三极的贴壁生长上皮型细胞(×200)

图210μ mol/L毛喉素作用48h后，即能发现细胞树状突数目明显增多，但长度并不加长(×200)

M：Marker,A:空白对照，B：8－MOP，C：8－MOP＋毛喉素，D：毛喉素

图3RT－PCR测定毛喉素与8－MOP单独或联合处理组酪氨酸酶

3.试剂配制与实验分组：毛喉素，8－MOP贮液用DMSO新鲜配制，避光保存在－20℃冰箱 备用。临用时用新鲜培养基调至终浓度。参照文献^[2]和我们早期的实验结果^[1]，选定药 物处理终浓度毛喉素为10μmol/L；8－MOP为50μmol/L。实验分组为：毛喉素，8－MOP单 独处理组;“毛喉素＋8－MOP”联合处理组;空白对照组仅加入溶媒DMSO。

4.酪氨酸酶活性与黑素含量测定：参照我们以前报道的方法^[1]。

5.寡聚核苷酸引物合成：引物序列由日本神户大学医学部皮肤科YokoFunasaka博士提供。 2对引物均由中国科学院上海细胞所合成。小鼠酪氨酸酶基因引物序列为：5'－ TTCAAAGGGGTGGATGACCG－3'（正向）；5'－GACACATAGTAATGCATCC－3'（反向），预期 扩增片段长度319bp。小鼠β－肌动蛋白引物序列为：5'－TCAGAAGGACTCCTATGTGG－3'（ 正向）；5'－TCTCTTTGATGTCACGCACG－3'（反向），预期扩增片段长度500bp。

6.培养细胞总RNA抽提：参照TRIzol试剂盒提供的细胞总RNA抽提步骤并稍作改良，主要步 骤为：细胞匀浆→分相→RNA沉淀→RNA洗涤→RNA重溶。紫外分光光度计测定总RNA浓 度。A260nm/A280nm为1.8～2.0。置－70℃冰箱保存。

7.RT－PCR:参照AccessRT－PCRsystem试剂盒提供的实验步骤。50μLPCR反应终体积内含: AMV逆转录酶50U;TflDNA聚合酶50U;4种dNTP各0.2mmol/L;MgSO41mmol/L;引物(正向/反向)各1 pmol/L;RNA模板50ng。2个基因扩增的热循环参数为：48℃，保温45min;94℃,变性2min，逆 转录合成第1链cDNA。随后按以下步骤合成第2链cDNA及PCR扩增。94℃，变性1min;53℃ ,退火1.5min;72℃,延伸1min。共扩增40个循环，最后1个循环结束后继续于72℃延伸7min。 整个过程在热循环仪中自动完成。

8.PCR产物分析：取PCR扩增产物8μL行质量分数为2％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕用含4 μg/mL溴化乙锭的0.5×TBE进行染胶，随后在凝胶扫描仪上观察结果，拍照记录并用 Labworks3.0软件对扩增产物进行光密度分析。酪氨酸酶基因表达水平以酪氨酸酶mRNA A值/β－肌动蛋白mRNAA值来表示。mRNA上调百分率(％)=(1－处理组A值/空白对照组A值 )×100。

9．数据处理和统计分析:所测实验数据采用配对计量资料t检验。统计过程使用SPSS统计 软件完成。

结果

（一）毛喉素对B16F10细胞形态的影响：传代培养的B16F10细胞主要为两极,偶见三极的 贴壁生长上皮型细胞(图1)。与50μmol/L8－MOP相比，10μmol/L毛喉素作用48h后，即能发 现细胞树状突数目明显增多，但长度并不加长。72h后观察这些形态变化更加明显(图 2)。

（二）毛喉素对8－MOP诱导的酪氨酸酶活性、黑素含量以及细胞计数的影响：结果见表 1。单独用10μmol/L毛喉素，50μmol/L8－MOP处理细胞所测的酪氨酸酶活性和黑素含量 与对照组相比均明显增加近1～2倍。当毛喉素与8－MOP联合处理细胞时所测的酪氨酸酶 活性和黑素含量与单独添加毛喉素、8－MOP时相比二者均显著增加(P＜0.05)。但联合处理 组较单独处理组活细胞计数明显减低，统计学上差异有显著性(P＜0.01)。提示毛喉素能增强8－MOP诱导的黑素生成作用，同时抑制黑素细胞的体外 增殖。

（三）毛喉素对8－MOP诱导鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶基因表达水平的调节：RT－PCR测定 毛喉素与8－MOP单独或联合处理组酪氨酸酶mRNA表达水平见图3。酪氨酸酶mRNA表达水 平，8－MOP与毛喉素单独处理组较空白对照组上调百分率分别为26.06％和6.58％，而联 合处理组为56.82％。提示酪氨酸酶mRNA表达水平上调以联合处理组最高，其次是8－ MOP组和毛喉素组。提示毛喉素能在基因转录水平明显增强8－MOP诱导的酪氨酸酶 mRNA表达。

表1 毛喉素对8-MOP诱导B16F10细<