【摘要】目的探讨原癌基因c－myc、抑癌基因p53和凋亡保护基因bcl－2在银屑病角质形成细胞凋亡异常中的作用。方法采用免疫组化和非同位素核酸原位杂交技术从蛋白和mRNA二个水平检测了36份寻常型银屑病皮损中c－myc、p53和bcl－2的表达状况。结果银屑病表皮中的c－myc、p53和增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞较正常皮肤明显增加，而bcl－2阳性细胞在表皮基底层中明显减少。在PCNA阳性细胞＞30的银屑病皮损中，有更多的c－myc阳性细胞(P＜0.01)、更多的p53阳性细胞(P＜0.01)，bcl－2的表达明显下降(P＜0.02)及更多的凋亡诱导(P＜0.01)。结论银屑病时c－myc、p53的表达上调和bcl－2的表达下调可能共同激活了角质形成细胞的凋亡通路，银屑病时角质形成细胞的凋亡增加与异常活化和增殖密切相关。

Study on the Relationship Between c－ myc, p53 and bcl－ 2 and Abnormal Apoptosis of Keratinocytes in Psoriatic Lesions

NI Xiao，SUN Jianfang，ZENG Xuesi，et al.

（Department of Pathology, Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Nanjing 210042）

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of proto－ oncogene c－ myc, tumor suppressor gene p53 and apoptosis protection gene bcl－ 2 on abnormal apoptosis of keratinocytes in psoriatic lesions. Methods Expression of c－ myc, p53,bcl－ 2 was analysed by both immunohistochemical methods and nucleic acid in situ hybridization in a total of thirty-six lesional skin samples from patients with psoriasis vulgaris. Results c－ myc, p53 and PCNA－ positive keratinocytes increased significantly in psoriatic lesions in comparison with the controls,especially in the lower and basal layers of epidermis. bcl－ 2－ positive cells decreased in basal layers of psoriatic skin. In lesions with more than 30 PCNA－ positive cells, there were a significant increase of c－ myc protein (P＜ 0.01) and p53 protein (P＜ 0.01), a significant decline of bcl－ 2 protein (P＜ 0.02), and a significantly high rate of apoptosis (P＜ 0.01). Conclusions The increased expression of c－ myc, p53 and the

decreased expression of bcl－ 2 may play a role in coordinated activation of apoptotic pathways in psoriatic skin. The abnormal apoptosis of keratinocytes is likely to relate to hyperplasia of keratinocytes in the psoriatic lesions.

【 Key words】 Genes,c－ myc Genes,p53 Genes,bcl－ 2 Psoriasis Apoptosisbcl

bcl－2在正常表皮基底细胞中表达，它能够拮抗由p53诱导的细胞凋亡，不能抑制p53的生 长停滞效应，但bcl－2与原癌基因c－myc的共表达则能有效地拮抗p53的G1期停滞和细胞凋 亡二种作用，提示bcl－2与c－myc间存在着协同作用，而bcl－2与p53间则存在着拮抗关系 ^[1]。本研究采用免疫组化技术和冰冻超薄片组织核酸原位杂交技术对银屑病各期皮损内 的c－myc、p53及bcl－2的蛋白和mRNA二个水平进行了检测，同时检测了增殖细胞核抗原 （PCNA）在银屑病皮损中的表达情况。

材料和方法

一、材料

1．标本来源：钻孔切取寻常型银屑病皮损36份，其中进行期（活动性、点滴状皮损）、 静止期（慢性、斑块状皮损）和退行期皮损各12份。男24例，女12例，男女比例为2∶ 1，患者年龄13～70岁,平均(34.6±13.8)岁；病程半个月至240个月,平均(56.8±70.9)个月； PASI评分3.0～47.5，平均(10.7±11.1)分。慢性湿疹标本4份、基底细胞癌标本4份和正常人皮 肤14份。

2．抗体和探针：实验所用鼠单克隆抗体包括，PCNA(PC10,IgG2,κ)，bcl－2(124,IgG1,κ)， p53(Do7,IgG2b,κ)和c－myc(C－8,IgG2,α)，前3种购自 Dako公司，c－myc为SantaCruz产品。所用cDNA裸探针均为SABC产品，包括h－c－myc(1.4 kb,8q24)，p53(1.8kb,17p13.1)和bcl－2(1.7kb,18q21)。

二、方法

1．免疫组化技术采用标准ABC法：一抗滴度PCNA和p53为1∶100，bcl－2和c－myc为1∶50。 p53和bcl－2检测切片均先经蛋白酶K和微波抗原修复预处理。

2．非同位素超薄片核酸原位杂交技术：①探针标记：使用BoehringerMannheim公司生产的 DigDNA标记检测试剂盒进行cDNA探针随机引物标记，以六聚核苷酸诱导带有Dig－dUTP的 DNA探针合成^[2]，然后行标记效率检测。②冰冻超薄片原位杂交：在路建平描述的薄片 组织原位杂交方法上加以改进^[2,3]，主要步骤如下：标本切取后固定、脱水；OCT包埋后 ， －16℃～20℃连续切片（片厚5～6μm)；0.1mol/LPBS、0.1mol/L甘氨酸及0.4％TritonX－100漂 洗；1μg/mL蛋白酶K消化；0.25％乙酸酐,0.1mol/L三乙醇胺反应；预杂交液37℃孵育1h； 切片挑入盛有200μL杂交液（50％甲酰胺、4×SSC、5×Denhardt液、0.5ng/μL变性探针、 100μg/mL鲑鱼精DNA、10mmol/LDTT、2％SDS及10mg/mL酵母tRNA)的离心管，43℃孵育12～ 16h；梯度SSC漂洗；AKP标记的抗DigFab片段（1∶1000)室温4h；NBT/BCIP显色过夜；切片 贴于硅化载玻片上，常规封片。③末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）介导的dUTP生物素缺口 末端标记技术（TUNEL）^[4]。

三、结果判断

1．免疫组化和TUNEL结果的判断：每张阳性切片选取5个高倍视野（×400），计算500个 角质形成细胞(KC)（PCNA、c－myc和p53）中阳性细胞所占百分比及凋亡指数（AI）^[4]。 bcl－2则参照Chung等的标准略加修改，按表皮基底层阳性细胞的数量将结果分为4级： 0=无或很少阳性细胞（0～＜20％）,1=较少阳性细胞（20％～80％）,2=基底细胞全层染色 （80％～100％，如正常皮肤的bcl－2表达),3=基底层及以上数层有阳性细胞者^[5]。

2．原位杂交结果的评价：①阳性反应的细胞定位和表皮定位；②染色强度：阴性（－ )、弱(＋)、中()和强()；③染色频度按阳性细胞的百分比分为4级：阴性（＜1％)、低 表达(1％～＜10％)、中表达(10％～50％)和高表达（＞50％)；④分析与相应蛋白表达的关系 。

四、数据统计与检验

所有百分数均经平方根反正弦转换（sin－1p)后进行检验，先行方差齐性检验，方差齐 用t检验和方差分析，方差不齐则用t′检验，均数间的比较采用q检验法（Newman－ Keuls法），对等级资料进行了Ridit分析，变量间相关关系采用Spearman等级相关分析。

结果

一、免疫组化和TUNEL检测结果

银屑病皮损与正常皮肤的检测结果见表1、2。相关性研究发现，银屑病皮损表皮中 PCNA的表达增加与c－myc、p53的表达增加、bcl－2的表达减少及凋亡指数（AI)增加间有 密切的关系。PCNA阳性细胞数＞30与＜30的银屑病皮损比较，前者c－myc和p53的表达均显 著上调（P＜0.01），bcl－2的表达显著下降（P＜0.05），凋亡也明显被诱导（P＜0.01），见 表3。在c－myc阳性细胞数＞10与＜10的银屑病皮损比较，前者PCNA与p53的表达均增加（P＜ 0.01），凋亡也明显被诱导（P＜0.01），bcl－2虽然表达下调，但差异无显著性（P＞0.05） （表4）。

4份基底细胞癌损害均示PCNA、c－myc、p53及 bcl－2高表达，未见凋亡细胞。对4例慢性湿疹皮损进行的检测结果显示，除PCNA亦呈同 样的中、高表达外，c－myc、p53及bcl－2的表达情况类似正常皮肤（资料未显示）。

二、原位杂交结果

1.c－myc阳性反应定位于胞浆，在银屑病皮损中呈c－myc高表达，阳性细胞分布于颗粒层 以下的整个棘层和基底细胞层，棘层更密集，染色强度（＋）～（），与c－myc蛋白 的皮肤定位相似，但细胞定位不同。正常皮肤中亦见c－myc的中、高表达，提示银屑病 皮损和正常皮肤中c－myc的转录水平接近，银屑病时增加的c－myc表达可能发生在转录后 水平。

2.p53的阳性反应为胞浆型，在正常表皮和银屑病表皮各层均可见阳性细胞，呈中、高表 达，但正常皮肤的阳性染色较弱（＋），而银屑病皮损染色强度在(＋)～()之间，这与 p53蛋白在银屑病皮损和正常皮肤中的检测结果基本一致。

3.bcl－2的阳性反应定位于细胞核和细胞浆，在正常表皮和银屑病表皮中均有高低不等的 表达，正常表皮的阳性反应全层可见，阳性染色弱（＋），银屑病表皮内阳性反应分布 于基底上各层，染色较强（），少数皮损中也见阳性细胞呈局灶性分布，这与bcl－ 2蛋白的表达模式大不相同。