【摘要】目的用随机引物扩增新生隐球菌临床和 环境分离株的DNA，观察DNA指纹与血清型的关系，探索新生隐球菌基因分型标准。方法采用3种不同寡核苷酸重复序列［CN₁(GTG)₅、CN₂(GACA) ₄和CN₃(GATA)₄］为引物，对从临床和鸽粪中分离到的24株血清A型和8株四种血清 型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增，根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之 间的关系。结果24株临床和鸽粪分离的血清A型株中，20株产生 和标准株完全相似的DNA带型，1株与标准D型DNA带型相似。3株的PCR指纹与血清A、B、C 、D型均不相同。2株B型和2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型(gatti i变种)的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用 于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。

Typing ofCryptococcus neoformans by Random Amplificatio n of DNA FingerprintingWen Hai, Liao Wanqing, Yao Zhirong, et al. Cr yptococcus Laboratory, Department of Dermatology, Changzheng Hospital attached t o the Second Military Medical University, Shanghai 200003

【Abstract】ObjectiveTo investigate the DNA typing, observe relationship between DNA fingerprinting patterns and serotypes of Crypto coccus neoformans, and find a suitable genotyping standard for C rypt ococcus neoformans.MethodsThree primers, including CN ₁(GTG)₅, CN₂(GACA)₄ and CN₃(GATA)₄, were used to distinguish v ariations among strains of C.neoformans.ResultsThe distinguishable fingerprinting bands for serotype of C.neoformans were yielded by primer CN₂. Using this primer, of 24 clinical and env ironmental isolates of serotype A of C.neoformans and 8 standard strains investigated by PCR, 20 strains produced complete identical fingerprin ting patterns, the other 4 strains had different fingerprinting patterns. 2 stra ins of serotype B and C yielded indistinguishable fingerprinting patterns.Conclusions①The majority of strains of serotype A had similar and stable finge rprinting patterns. ②Some strains of serotype B and C had an indistinguishable fingerprinting patterns. ③The same serotype strains from different sources may produce different DNA fingerprinting patterns. ④The DNA fingerprinting is a rap id, simple and feasible method for identifying Cryptococcus neoformans .

【Key words】Cryptococcus neoformansPCRPrimer

新生隐球菌是重要的条件致病菌之一，为调查新生隐球菌的流行情况，许多 学者在该菌的形态学、血清学及分子生物学方面开展了许多工作。血清学已将该菌分为四型 ，即A、B、C和D型^［1］，但这一分型方法不能区别新生隐球菌菌株 间的差异，因此建立一种敏感而可靠的分型方法已显得十分迫切。目前几种分子生物学分型 方法已建立^［2～5］，其中包括新生隐球菌DNA核型分析，DNA限制 性片段长度多态性分析(RFLP)，但这两个方法均存在某些缺点，核型分析设备要求高，实验 时间长，不适合大样本的检测，而RFLP的分辨率不高，而且由于DNA片段的类型复杂，客观 评价比较困难。近年来用PCR方法随机扩增DNA多态性来区分新生隐球菌菌株间的差异已显示 出许多优越性^［6，7］。据此，我们用随机引物扩增法检测了一批 来自不同国家和地区的临床和野生分离株，获得满意结果。

材料和方法

(一)实验菌株：本研究采用32株新生隐球菌菌株，其中24株为血清A型(分离 自意大利AIDS和非AIDS患者各6株；中国非AIDS患者6株；6株自意大利鸽粪中获得)，8株标 准菌株中，由美国国立卫生研究所Kwon-Chung教授馈赠血清B、C和D型各1株，法国巴斯德 研究所赠送血清A型2株，B、C和D型各1株。

(二)主要试剂：YMA琼脂培养基购自美国Sigma公司，血清分型试剂盒购自日本Iatron Labor atories Inc公司，PCR反应试剂盒购自德国Bochringer-Mannkeim公司，DTAB、CTAB和Novo zym234酶购自美国Sigma公司，引物(GTG)₅、(GACA)₄和(GATA)₄由意大利Primm sr l公司合成，PCR扩增仪为美国生产(Gene Amp PCR system 9600)。

(三)DNA制备：实验菌株在沙堡琼脂培养基上32℃培养48小时，然后转种到YMA琼脂培养基上 32℃过夜，次日用1ml蒸馏水收集菌体，采用经过改进的微量抽提法制备隐球菌DNA，操作过 程：将收集到的菌体(每毫升含10^7～8个菌体)，用SCS缓冲液洗涤1次，加1毫升原 生质体形成液(1毫升SCS缓冲液内含20mg Novozyme234酶)悬浮菌体，放37℃水浴30分钟，取 10μl原生质体液加2% SDS 10μl放载玻片上，混匀后用相差显微镜检查原生质体形成率， 如原生质体超过70%则进行下一步实验。4000r/min离心5分钟收集原生质体，去上清液后加6 00μl溶解液(8% DTAB，1.5mol/L氯化钠，100μmol/L Tris pH8.6，50μmol/L ED

TA)6 8 ℃温浴20分钟，加900μl氯仿充分混匀，12000r/min离心10分钟，移300μl上清液(内含D NA )到新的试管，加700μl蒸馏水和100μl CTAB液轻轻摇匀，10000r/min离心2分钟，倒掉 上 清液后加150μl 1.2mol/L氯化钠，轻轻摇匀，加500μl纯乙醇，10000r/min离心10分钟 ， 再用70%乙醇洗涤1次，在真空离心机内干燥离心，待DNA完全干燥后加30μl纯蒸馏水稀释， 放-20℃冰箱备用。

(四)PCR扩增：采用3个简单的寡核苷酸重复序列CN₁(GTG)₅、CN₂（GACA） 4和CN₃(GATA)₄为引物。对制备好的隐球菌DNA在PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl，其中包括：5μl 10×PCR反应缓冲液，3μl氯化镁溶液(3mol/L)，4μl dNTP(400μmo l/L)，10μl引物(100pmol/L)，0.5μl Taq DNA聚合酶(2.5U/L)，2μl DNA模板，25.5 μl灭菌双蒸水。PCR反应条件：变性94℃ 30秒；退火46℃ 30秒；延伸72℃ 60秒；共40个 循环，最后在72℃延长6分钟。扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶内电泳，在紫外灯下照像记录 电泳结果。

结果

1.3种引物的筛选结果：实验采用3种引物在完全相同的实验条件下扩增3 株 相同血清型的新生隐球菌DNA，结果显示CN₂(GATA)₄产生的电泳带型比CN₁和CN 3清晰而且分辨率高(图1)。

1泳道为标准DNA分子量；2、3、4泳道为引物CN₁ ；5、6、 7泳道为引物CN₂；8、9、10泳道为引物CN₃

图13种引物对3株血清A型新生隐球菌DNA的PCR扩增结果

2.4种血清型的PCR扩增结果：4种血清型不管是DNA电泳带的位置还是密度均有明显的不同 ，但是新生隐球菌gattii变种(血清B和C型)的主要DNA带型几乎不易区别(图2)。

1泳道为DNA标准分子量；2、3泳道为A型；4、5泳道为B型；6、7泳道 为C型；8、9泳道为D型

图2新生隐球菌4种血清型的PCR扩增结果

3.血清A型株间的扩增结果：不同来源的血清A型菌株产生完全相同的PCR扩增带型，这些菌 株包括来自意大利的AIDS患者，中国的非AIDS患者和意大利的野生分离株(图3)。

1泳道为DNA标准分子量；2泳道为标准株；3 、4、5泳道为 意大利的AIDS患者；6、7、8泳道为中国的非AIDS患者；9、10、11泳道为意大利 的鸽粪中分离株

图3不同地区和不同来源的A型株PCR扩增结果

4.意大利的非AIDS患者的血清A型菌株PCR扩增结果：6株菌株产生了几种基因带 型，其中2株与A型相似，1株与D型相似，其余3株无法分型(图4)。

1泳道为DNA标准分子 量；2～7 泳道为意大利非AIDS患者分离株

图46株意大利非AIDS患者A型株的PCR扩增结果

讨论

新生隐球菌的分型对该菌的流行病学调查以及新生隐球菌病的防治研究都具 有重要意义。目前已有几种分子生物学的方法被建立，其中包括染色体电泳核型分型，线粒 体DNA酶切片段长度多态性及多种酶的分型，但是以上方法都存在分辨率不高，操作复杂等 缺点。据此，我们用随机引物扩增法检测了一批来自不同国家和地区的临床和野生分离株， 获得满意结果。