【摘要】从一例甲真菌病患者的病甲标本中分离出糠秕孢子菌，并进行了培养、组织病理、扫描电镜、溶甲等研究。患者为64岁女性，因指趾甲变色、增厚、粗糙20余年就诊。体检见各指、趾甲增厚变色，表面粗糙不平，指甲前端甲板与甲床分离。指甲培养结果发现在沙堡培养基有红色毛癣菌生长，在含菜子油培养基有卵形糠秕孢子菌生长。病理检查发现甲组织裂隙中有卵形出芽孢子，扫描电镜观察见大量有颈圈样结构的卵形出芽孢子镶嵌于甲组织中。20%KOH、56℃处理1小时的甲沉淀物涂片经Parker墨水染色后镜下可见与卵形糠秕孢子菌和红色毛癣菌形态一致的孢子和菌丝。患者接受伊曲康唑间歇冲击治疗，第四疗程结束后1～2月时甲颜色明显光亮，以后未见进一步好转。治疗结束后6个月时再剪病甲培养又有红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌生长。结论此为国内首次报道卵形糠秕孢子菌与甲真菌病有关。复习文献，对红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌在发病中的地位进行了讨论。

Isolation of Pityrosporum ovale from a Patient with Ony chomycosis: Clinical and Laboratory Investigation

Ran Yuping*, Zhou Guangping, Li Wei, et al. *De partment of Dermatovenereology, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

【Abstract】ObjectiveTo isolate and observe Pityrosporum yeasts from a patient with onychomy cosis. MethodsThe involved nail specimens were investigated by means of culture, patholog ical and scanning electron microscopic examination and 20% KOH preparation. ResultsPhysical examin ation showed that each finger and toe nail appeared brownish-black, rough and t hick, s ome of the fore part of the nail plate detached from the nail bed. Fingernail sp ecimen's culture results showed that Trichophyton rubrum grew on Sabouraud's dex trose agar and Pityrosporum ovale grew on the medium containing rapeseed oil. Th e pathological examination revealed P.ovale yeast involvement in the fissure o f the nail plate. Under the scanning electron microscopy, a lot of P.ova le yeast s with characteristic collarette structure inserted in the nail tissue was notic ed. In the 20% KOH preparations of nail incubated at 56℃for 1h and stained wi th Quink Parker ink, spores and hyphae were identified morphologically with P.ov ale and T.rubrum respectively. The patient received inte rmittent pulse therapy with itraconazole, the color of the nails became much brighter 1 to 2 months a f ter the fourth cycle of therapy, but no further improvement was observed aft erward s. P.ovale and T.rubrum grew again 6 months afte r treatment when the clippings of the fi ngernail were cultured. Conclusion This is the first document of onychomycosis related with P.ovale in China.

【Key words】OnychomycosisPityrosporum ovaleTr ichoph yton rubrumMicroscope, electron

糠秕孢子菌除是花斑癣、糠秕孢子菌毛囊炎的致病菌外，也与间擦疹、脂溢性皮炎、头屑过多、银屑病、异位性皮炎有关^［1］；从80年代中期开始陆续有由该菌引起系统感染的报道^［2］。国外已有4篇文献报道从甲标本中发现糠秕孢子菌^［3～6］。我们报道1例从甲真菌病患者病甲中培养出红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌，用扫描电镜重点观察了卵形糠秕孢子菌在病甲的分布和形态特征。

病历资料

患者女，64岁，教师。因指趾甲变色增厚于1996年4月10日就诊。20余年前双手掌起深在性水疱、瘙痒，持续半月后各指间起水疱、瘙痒，以后右手无名指甲缓慢变色，前端变空，其余指甲及双足各趾甲也逐渐变色、增厚。15年前曾用“甲癣药水”数十天后有部分新甲长出，但停药后又复发。10年前偶然发现头枕部有一鸡蛋大面积头发脱落，未接受治疗；近2年因骨质疏松常规服小剂量女性激素。无糖尿病、花斑癣、头皮屑多等病史，从未外用过指(趾)甲油，无搔抓头皮习惯。体检见各指、趾甲不同程度增厚，表面粗糙不平，有顶针样改变，双侧食指、中指、无名指前端1/3至1/2甲板与甲床分离，污褐色至绿黑色（图1），未见手、足癣表现，枕部有约5cm×6cm卵圆形脱发区，其中有稀疏头发长出。

图1患者手部皮损

实验室研究及结果

（一）培养：刮去病甲表层后取甲屑及剪远端病甲，接种于含氯霉素、放线菌酮的沙堡培养基(室温)和含菜子油沙堡培养基^［7］(37℃)培养。在沙堡培养基中长出白色绒毛状菌落，随时间经过白色羊毛状菌丝充满斜面，菌丝紧贴管壁，边缘清楚，培养基变为红葡萄酒色。用玻片法做小培养见丝状菌丝及棒状侧生小分生孢子，鉴定为红色毛癣菌（图2）。在含菜子油沙堡培养基长出乳酪色酵母样菌落，在培养基表面生长，镜下观察为卵形出芽孢子，芽颈较宽，厚壁，鉴定为卵形糠秕孢子菌（图2）。

图2小培养鉴定为红色毛癣菌，含菜子油沙堡培

养基鉴定为卵形糠秕孢子菌(右上角)

（二）组织病理学观察：剪取指甲远端病甲，经10%甲醛固定后置脱钙液(浓盐酸20ml，氯化钠7.5g，蒸馏水1000ml)中脱钙5天，流水冲洗6～8小时后，常规脱水，石蜡包埋切片(3μm)，HE、PAS、氯胺银染色。发现甲组织表面有裂隙，其间有大量卵形出芽孢子，PAS染成棕红色，氯胺银染成黑色，未见到菌丝。

（三）扫描电镜观察：将病甲用2.5%戊二醛固定24小时后用磷酸盐缓冲液冲洗，用30%～100%酒精逐级脱水(每级15～30分钟)，醋酸异戊酯置换(15～30分钟)，CO₂临界点干燥、离子溅射，AMRAY1000-B型扫描电镜下观察并照像。见甲表面及断面凹凸不平，甲结构破坏严重，有很多裂隙及大量不规则甲组织碎屑，甲组织内充满大量卵形出芽孢子，有典型的颈圈样结构^［8］，部分或大部分镶嵌入甲组织内（图3～6），未见菌丝及不出芽的分生孢子，部分视野见到细菌。

图3～6扫描电镜下观察病甲组织

（四）KOH溶甲观察：将病甲置于20%KOH中，56℃水浴1小时后离心弃上清液，用生理盐水洗涤2次后将沉淀物涂片，经50%Parker墨水染色5分钟，用蒸溜水洗去多余染料后封片镜下观察。可见大量卵形出芽孢子和较多细长分隔菌丝，此菌丝与培养生长的红色毛癣菌镜下所见形态一致。

治疗及预后

采用伊曲康唑间歇冲击疗法（共4个疗程）：第一疗程每日口服200mg共7天，从第二疗程开始改为200mg每日2次共7天，每疗程间隔3周。服药3个疗程后从甲根部开始有淡红色新甲长出，并逐渐向前推移，到第四疗程结束后1～2个月时各甲与甲床未分离的甲板色泽淡红，与甲床分离的甲板颜色较治疗前明显变淡，以后病甲未见进一步好转，到治疗结束后6个月时各甲后部分表面仍不平整，各甲板与甲床分离部分颜色虽较接受治疗前变浅，但未完全恢复正常。

服药第三疗程起每月剪远端病甲做KOH溶甲后涂片未见卵形出芽孢子，但仍可见细长分隔菌丝，将病甲分别接种到前述两种培养基作培养均阴性（共3次）。细菌培养有革兰阳性杆菌生长，未做菌种鉴定。伊曲康唑间歇冲击疗法结束后6个月时再剪远端病甲分别接种到前述两种培养基培养，又有红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌生长。

讨论

本例采用普通和含油的沙堡培养基，从同一患者病变指甲同时培养出红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌，病理切片和扫描电镜观察发现卵形出芽孢子但未见到菌丝，这可能与切片只能看到断面，扫描只能观察断面表面有关，为弥补方法学上的不足，将部分病甲置于20%KOH中，经56℃水浴将病甲全部溶解，离心洗涤后的沉淀物涂片，Parker墨水染色后镜下发现大量卵形出芽孢子和较多细长分隔菌丝，证实病变甲组织中确实存在红色毛癣菌和卵形糠秕孢子菌这两种形态的真菌。

红色毛癣菌是甲真菌病最常见的病原菌，该菌分泌的蛋白酶可分解角蛋白，在菌体侵入甲组织过程中起重要作用^［9］。糠秕孢子菌的细胞壁/膜有脂酶活性^［10］，可将脂质分解为脂肪酸以利菌生长繁殖。糠秕孢子菌分泌蛋白酶的假设至今尚未被证实。Dion等^［3］首先注意到甲组织中存在糠秕孢子菌，但并不认为是甲病变的病原菌；Civila等^［4］认为它是引起甲床炎的病因；将糠秕孢子菌与甲真菌病联系在一起的是Crozier等^［5］，他们报道了10例，受累部位有手指甲6例、脚趾甲4例。表现为甲下角化过度、甲分离，甲远端及侧缘白黄色或棕褐色。镜