【摘要】目的从分子水平探讨白念珠菌(简称白念)与宿主细胞的粘附机制。方法和结果用非离子去垢剂辛基吡喃葡萄糖苷提取白念孢子壁蛋白质，然后制备纤连蛋白Sepharose 4B亲和柱，运用亲和层析技术从上述提取液中分离纯化纤连蛋白粘附素，在非还原状态进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，得到表观分子量60 000和105 000的二条蛋白带。为了弄清此蛋白在白念与宿主细胞粘附中的作用，把人颊粘膜上皮细胞与白念孢子共同振荡孵育2小时，显微镜下测定上皮细胞表面粘附白念的数目，白念与上皮细胞的粘附百分率为44.7±6.28，上皮细胞经纤连蛋白粘附素预处理后，粘附百分率为28.3±6.18，P＜0.01。结论纤连蛋白粘附素介导了人颊粘膜上皮细胞与白念的粘附。

Isolation and Purification of Adhesin of Candida Albican s and its Effect on Adherence to Host CellsLiu Xiaohong, Lia o Wangqing, Hu Huiming, et al. Department of Dermatology, Eighty-eighth Hospita l of Jinan Military Area Command, Taian 271000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the adherence mecha nism of Candida albicans to host cells in molecular level.Methods and ResultsYeast cell wall protein of Candida albicans we re extracted, and purified fibronectin (Fn) adhesin was obtained from yeast cell wall extract. Fn adhesin was anal yzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weights of Fn adhesin were 60kd and 105kd. In order to find out t he effect of the protein on adherence to host cells, human buccal epithelial cells and Candida albicans cells we re i ncubated at 37℃ for 2 hours on a rotator, and yeasts adhering to the surfaces o f epithelial cells were assayed microscopically. The adherence rate of C .albicans to buccal epithelial cells was 44.7±6.28%, and after treati n g the epithelial cells with Fn adhesin, the adherence rate reduced to 28.3±6. 18%, P＜0.01.ConclusionT he results indicate Fn adhesin could mediate adherence of Candida albic ans to epithelial cells.

【Key words】Candida albicansFibronectinAdhere

白念珠菌(白念)是重要的条件致病菌，可侵犯皮肤、粘膜和内脏。研究表明白念与宿主细胞间的粘附是其侵入宿主引起感染的前提，在介导白念与宿主细胞的粘附中，纤连蛋白(Fn)起了重要作用^［1］。我们运用Fn做亲和配体，用亲和层析技术从白念孢子壁蛋白提取液中成功地分离纯化了Fn粘附素，而且验证了其能介导人颊粘膜上皮细胞与白念的粘附。

材料和方法

一、材料

1.白念为长征医院皮肤科中国医学真菌保藏管理中心提供，为临床分离的菌株D67，血清型A型。

2.试剂来源：Fn、溴化氰活化的Sepharose 4B、辛基吡喃葡萄糖苷、抑胃肽A、苯甲基磺酰氟、牛血清白蛋白均购自Sigma公司，199细胞培养液为日本进口，低分子标准蛋白购于上海东风生化试剂厂。

二、方法

1.白念孢子的培养、收集^［2］：取新鲜转种至葡萄糖蛋白胨培养基上的白念一铂环接种于YEPD培养基中，26℃振荡孵育20小时，离心收集白念孢子(300g，3分钟)，用0.1mol/LTris-HCl缓冲液(含2mmol/L的钙和镁)冲洗3次。

2.白念孢子壁蛋白质提取液的制备^［3］：取上述白念孢子约35g(湿重)加入36ml0.1mol/LTris-HCl缓冲液(含2mmol/L钙和镁、50mmol/L辛基吡喃葡萄糖苷、6mmol/L苯甲基磺酰氟、2μmol/L抑胃肽A)26℃振荡孵育40分钟，高速冷冻离心(4℃)30 000g，90分钟后，小心抽取上清液，用染料法检测其蛋白质含量。

3.Fn粘附素的提取纯化：将白念孢子壁蛋白提取液首先上样到牛血清蛋白(BSA)-Sepharose 4B凝胶柱，用缓冲液A(含有2mmol/L的钙、镁和50mmol/L辛基吡喃葡萄糖苷的缓冲液)彻底冲洗至核酸蛋白检测仪A280时记录仪回到基线，然后将得到的洗脱液上样到Fn-Sepharose 4B，使其在层析柱中反复循环，速度为1ml/分钟，90分钟后，Fn-Sepharose 4B柱先用缓冲液A彻底冲洗至A280回到基线，后改用缓冲液B［不含有钙和镁，含有10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、50mmol/L的辛基吡喃葡萄糖苷的缓冲液］洗脱，收集蛋白峰对应的洗脱液，4℃冰箱中透析48小时，浓缩后进行SDS-PAGE。最后用1NNaCl再生Fn-Sepharose 4B柱。

4.Fn-Sepharose 4B及BSA-Sepharose 4B的制备^［4］：取溴化氰活化的Sepharose 4B放入小砂芯漏斗中，用预冷的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液冲洗后加入Fn或牛血清白蛋白，然后将上述混合物在4℃冰箱中用磁力搅拌器缓慢搅拌16～20小时进行偶联，最后用缓冲液彻底冲洗，直到流出液中没有蛋白质(A280低于0.02)为止。加防腐剂0.02%叠氮钠，贮存于4℃冰箱备用。

5.SDS-PAGE：采用分离胶为5%～15%连续梯度凝胶，0.25%考马斯亮蓝R250溶液染色。

6.白念孢子悬液的制备：将培养收集的白念，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤3次(300×g，3分钟)，然后加入199细胞培养液，用血细胞计数板调整至所需要的各种浓度。

7.颊粘膜上皮细胞(BEC)悬液的制备^［5］：用无菌棉签轻轻刮取受检者(正常学员10例，每次实验来自同一人群)两侧颊粘膜，用上述缓冲液离心洗涤3次，调整至所需要的各种浓度，具体方法同上。

8.粘附抑制实验^［6］：将上述制备的两种悬液各0.25ml加入试管中，其中上皮细胞浓度为10⁶／ml，白念孢子为10⁸／ml，在培养箱(37℃)中振荡孵育2小时后，使混合液通过12μm的过滤薄膜，再用pH7.4的PBS彻底冲洗，以除去未粘附到上皮细胞的白念孢子。然后将过滤薄膜倒置在载物片上2分钟，风干，热固定后进行革兰染色。在显微镜下计数，其中粘附孢子数20个以上的上皮细胞记(+)，共数出100个，计算出粘附百分率。先将Fn粘附素(100μg)加入到上皮细胞悬液中，37℃振荡孵育60分钟后，再加入白念孢子悬液，计算粘附百分率，具体方法同前。

9.统计学方法：这种同一观察单位前后二次测定结果的比较用t检验，所有数据的表示用平均值±标准差。

结果

1.白念孢子的收集及壁蛋白提取的结果：1000mlYEPD培养基共收集35g白念孢子，大约得到3.2mg的蛋白(用染料法测定蛋白含量)。

2.Fn粘附素提取纯化的结果：见图1。3.2mg白念孢子壁蛋白溶液经Fn-Sepharose 4B亲和层析柱后得到Fn粘附素大约20μg，SDS-PAGE见图2。

a：没有结合到层析柱上而用缓冲液A洗脱下来的蛋白峰，b：结合到层析柱上而用缓冲液B洗脱下来的蛋白峰即纤连蛋白粘附素，c：亲和层析柱的再生峰，A：缓冲液A，B：缓冲液B

图1白念孢子壁蛋白质提取液经纤连蛋白Sepharose 4B亲和层柱的洗脱曲线

图2纤连蛋白经纯化后SDS-PAGE

3.粘附抑制实验：白念与上皮细胞的粘附百分率为44.7±6.28；上皮细胞经Fn粘附素预处理后，粘附百分率为28.3±6.18，t=9.836，P＜0.01(粘附率是4次实验得到的±s，每次计数均重复一次)。

讨论

研究表明白念与宿主细胞间的粘附是其侵入宿主引起感染的前提，在介导白念与宿主细胞的粘附中，Fn起了重要作用。Fn是大多数宿主细胞上广泛存在的糖蛋白，在细胞粘附、细胞移动、炎症浸润、创伤愈合等方面均有重要作用。而这些功能的发挥大部分是从介导细胞粘附开始的，因此Fn介导的细胞粘附尤其引人重视。Skerl^［1］发现白念对Fn的粘附在许多方面与白念对上皮细胞的粘附非常相似。他们用间接免疫荧光技术，在许多上皮细胞表面都检测到Fn的存在。当把白念孢子和Fn及Fn的单抗共同孵育后，电镜显示孢子周围有颗粒状的沉积，证明Fn结合在白念孢子的表面。用Fn预处理白念后，可以阻止其对人颊粘膜上皮细胞和阴道粘膜上皮细胞的粘附。Kloze等^［7］证实了Fn对白念的结合具有特异性、高亲和性和饱和性。这些结果表明Fn作为宿主细胞表面的受体而发挥作用，白念表面有与Fn结合的粘附素。

本实验即在已有研究基础上用Fn做亲和配体，运用亲和层析技术从白念孢子壁蛋白提取液分离纯化与Fn结合的粘附素，并验证该蛋白能抑制白念与上皮细胞的粘附。要分离纯化白念表面的粘附素，首先要使白念表面的蛋白溶解，然后才能根据其特性进行分离。去垢剂能削弱膜蛋白与膜脂质分子间的疏水结合，使膜蛋白从膜脂质双分子层中溶脱，同时又能保持膜蛋白原有构象和功能。所以我们应用去垢剂辛基吡喃葡萄糖苷提取<