摘要根据编码M6蛋白的emm6基因序列设计一对寡核苷酸引物 ，可特异扩增220bp的DNA片段。应用聚合酶链式反应(PCR)方法对 点滴型银屑病患者咽部培养出的19株细菌中的M6蛋白基因进行 检测，结果，15株链球菌中6株为阳性，其中化脓链球菌3株， 无乳链球菌、似马链球菌和乳房链球菌各1株，4株非链球菌均 为阴性。M6蛋白基因不仅存在化脓性溶血链球菌中，在其它链 球菌如乳房链球菌中也存在。研究结果显示，化脓性溶血链球 菌中的化脓链球菌、无乳链球菌和似马链球菌与点滴型银屑 病的发生有明显相关性，可能主要是菌体中的M6蛋白在起作用 ，其它含有M6蛋白的细菌如乳房链球菌也可诱发或加重银屑病 的发生。

Detection of M6- protein on pharyngeal florae of patients with guttate psoriasis by polymerase chain reaction

Zhao Guang, Feng Xiaoling, Jiang Yongqiang, Cai Qing, Na Aihua, Cai Ruikang, Du Xiaoyuan, Mei Yingjie

（Department of Dermatology General Hospital of Air force PLA, Beijing, 100036）

Abstract A pair of oligonucleotide primers derived form emm6, the gene encoding M6 protein, were chosen to specially amplify a 220bp DNA fragment. The PCR based assay was tested on 19 strains isolated in throats from patients with guttate psoriasis. The results demonstrated that 6 strains were positive in 15 streptococus strains among which there were 3 streptococus pyogenes, 1.S.agalactiae, 1 S. eguisimilis and 1 S. uberis, and 4 non- streptococus strains were negative. Emm6 was found not only in suppurative hemolytic streptococus, but also in S.uberis. The results shows that suppurative hemolytic streptococus such as S. pyogenes, S. agalactiae and S. eguisimilis are obviously related to guttate psoriasis, and M6- proteins plays an important role. Other bacteria containing M6- protein liking S. uberis can alsc induce or exaggerate the psoriasis.

Key wards Guttate psoriasis Polymerase Chain Reaction Bacterium

银屑病是一种慢性复发性疾病，真正原因尚不清楚，近年 来研究发现，链球菌感染和银屑病之间有明显相关性^[1～3]， 并发现引起或加重银屑病与链球菌体中的M6蛋白有关^[1,4]。为 进一步证实链球菌超抗原和点滴型银屑病之间的关系，我们对 点滴型银屑病患者咽部培养出的菌群进行M6蛋白的检测，现将 结果报道如下。

1材料和方法

1.1细菌标本的采集、培养和鉴定

(1)标本的采集：对受检者咽部用消毒干棉球清理干净后再 用无菌棉试子在双侧咽部及扁桃体表面擦拭2遍获取标本，然 后将其接种到血琼脂培养基及链球菌分离培养基上进行培养。

(2)细菌的接种和培养由专业人员参照《全国临床检验规程 》进行完成。

(3)细菌鉴定使用法国生物梅里埃公司生产的VITEK-AMS60全自 动微生物鉴定系统，鉴定卡为GPI，每卡含30种不同的生化反应 ，依据生物编码的不同自动完成细菌鉴定。

(4)鉴定后的细菌在低温冰箱保存备用。

1.2临床资料

(1)对我院门诊中诊断明确的点滴型银屑病患者68例进行咽 部细菌分离培养和鉴定。68例中，男性33例，女性35例；年龄7 ～65岁；病程2天～2个月。

(2)培养鉴定结果：68例患者中共培养分离出链球菌64株，非 链球菌4株，链球菌中化脓性溶血链球菌14株，口腔链球菌50株 。

(3)对培养分离出的全部菌种中不同的19个菌株用聚合酶链 式反应(PCR)进行检测M6蛋白基因。

1.3PCR检测

(1)引物的设计与合成：通过Genbank得到各型M蛋白的核酸序 列，发现M6蛋白基因与其它M蛋白相

图1PCR对咽部细菌的检测结果

(1)1、13为阳性对照在220bp带呈阳性;(2)3、4、5为化脓链球菌在 220bp带呈阳性;(3)6、7、11分别为无乳链球菌、似马球菌、乳房 链球菌均在220bp带呈阳性;(4)2为阴性对照呈阴性;(5)12、24为正常 人中的缓症链球菌和中间链球菌呈阴性;(6)8～10和14～23的细菌 均呈阴性比，特异序列位于5’端，经multiplesequncealignment分析获得该 基因上游与其它M蛋白不同的特异序列，根据编码M6蛋白的emm6 基因序列，设计出一对寡核苷酸引物，可特异扩增针对M6蛋白 基因的220bp的DNA片段。引物1：CGGACAAAGCACGAGAAC；引物2：CTCCTTATTC TCAGTTGT.引物由军事医学科学院八所合成并纯化。

(2)标准菌株的设定和引物的验证：由中国药品生物制品鉴 定所提供2株国际标准的化脓性链球菌菌株，其中一株含M6蛋白 抗原，是来源于捷克流行病学微生物研究所，标号为32175，另 一株不含M6蛋白抗原，来源于英国DrVDALLISON(Wheatlay)，标号为 32115.用PCR方法对二株进行验证检测，以检验合成引物的正误。

(3)PCR模板的制备：将复活细菌的标本静化后以5000r/min离心 10min，去掉上清液，加入1％TritonX-100裂解液150μL，将标本加 热95℃30min后再以12000r/min离心10min，取上清液10μL作为待检DN A模板。

(4)PCR反应液50μL，其中引物1、引物2各0.5μL，10×Buffer5μ L，dNTP(0.2mol/L)4μL,TaqDNA聚合酶2u，DNA模板10μL，水28μL，液 体石蜡40μL覆盖液面。

(5)PCR循环：PCR扩增仪为美国PCR9600，首先94℃预变性2min，然 后以94℃1min，56℃1min，72℃1min20s，循环35次，最后1次循环 72℃10min。

(6)取15μL扩增产物于25g/L琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染 色，紫外分析仪下观察结果并拍照。

(7)对分离培养出的19个菌株进行检测，化脓性溶血链球菌7 株(其中化脓链球菌3株，无乳链球菌、似马链球菌、咽炎链球 菌和肺炎链球菌各1株)，口腔链球菌8株(其中变异链球菌、乳 房链球菌、中间链球菌、星座链球菌、血液链球菌Ⅰ、Ⅱ，缓 症链球菌、唾液链球菌各1株)，非链球菌4株(其中表皮葡萄球 菌2株，模仿葡萄球菌、铜绿假单胞菌各1株)。以32175株做为阳 性对照，蒸馏水做为阴性对照。

(8)对从正常人咽部培养出的2株非化脓链球菌，缓症链球菌 和中间链球菌进行了检测。

2结果

2.1中国药品生物制品鉴定所提供的2株化脓链球菌，标号为 32175含M6蛋白的一株在220bp带呈阳性，而标号为32115不含M6蛋白 的一株为阴性。

2.2银屑病患者咽部培养出的15株链球菌中，有4种6株在220bp 带呈阳性，4株非链菌均呈阴性。

2.3正常人咽部培养的2株链球菌中均呈阴性(见图1)。

2.4标号为32175的阳性对照组在220bp带呈阳性，阴性对照呈阴 性(见图1)。

3讨论

用PCR方法对点滴型银屑病患者咽部培养出的细菌检测M6蛋 白基因，结果发现，在15株链球菌中有6株含有编码M6蛋白基因 ，其中化脓链球菌3株，无乳链球菌、似马链球菌和乳房链球 菌各1株，这6株中前5株按新的链球菌分类均属于化脓性溶血链 球菌^[5]，而后一种属于口腔链球菌中的草绿色链球菌。在4株 非链球菌中均呈阴性反应。正常人咽部培养出的2株链球菌中 均呈阴性，这2株均属于口腔链球菌中的草绿色链球菌。化脓 性溶血链球菌中的咽炎链球菌和肺炎链球菌呈阴性反应。

文献报道链球菌中的M6蛋白是一种较特异性蛋白质，一般 只存在于化脓性溶血链球菌的细胞壁中，这种蛋白与人角质形 成细胞中的某些蛋白有同源性，两者之间易引起交叉反应， 所以这种M6蛋白作为一种超抗原可引起和加重银屑病的发生^{[6 ～8]}。本研究中的7株化脓性溶血链球菌中有5株均含有M6蛋白， 可能是引发点滴型银屑病的主要致病原，这和文献报道^[5,9]相 符，而咽炎链球菌和肺炎链球菌呈阴性反应，这二种一般不 会引起银屑病的发生，另一株口腔链球菌中的草绿色链球菌也 检出有M6蛋白基因。以前认为草绿色链球菌是属条件致病菌。 研究发现，M6蛋白不是在所有化脓性溶血链球菌中都存在，但在个别草绿色色 链球菌中也可以检出，说明这种M6蛋白并非特异存在于化脓性 溶血链球菌中。如果这种蛋白是引起银屑病的起动因子，那 么，凡含有M6蛋白的链球菌均可诱发或加重银屑病的发生。本 研究结果显示，化脓性溶血链球菌中的化脓链球菌、无乳链球 菌和似马链球与点滴型银屑病的发病有明显相关性，这种相 关性可能主要是细菌体中的M6蛋白在起作用，其它含有M6蛋白 的细菌如乳房链球菌是否也可诱发或加重银屑病的发生，仍需 进一步研究。

参考文献

1，Telfer NR. The role of streptococcal infection in the initiation of guttate psoriasis. Arch Dermatol,<