摘要为快速鉴别3类医学上重要真菌——念珠菌、曲霉和隐 球菌，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)的分 子生物学方法对白念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、近 平滑念珠菌、热带念珠菌、乳酒念珠菌、新生隐球菌格梯变种 、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌、烟曲霉、黄曲霉和杂 色曲霉进行体外研究。经PCR念珠菌、曲霉和隐球菌均扩增出31 0bp的DNA片段，再行限制性内切酶HaeIII消化后分别呈现2条、4条 和3条片段。本实验建立的PCR-RFLP技术鉴别念珠菌、曲霉和隐 球菌感染，具有快速和特异的特点，是对PCR诊断的重要补充， 有潜在的临床应用价值。

Identification of Candida, Aspergillus and Cryptococcus by using PCR- RFLP

Qin Zhenyu, Wu Shaoxi,Lu Guixia,Roy L. Hopfer, Zhang Hong,Guo Ningru

（Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing,210042）

Abstract The purpose of this study is to establish a sensitive and speedy technique to identify three medically important fungal species, Candida, Aspergillus and Cryptococcus. Twelve fungal species, including Candida albicans,Candida krusei ,Candida guilliermondii, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans var. gattii, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cryptococcus laurentii, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus and Aspergillus versicolor were identified by using polymerase chain reaction(PCR)- restriction fragment length polymorphism(RFLP) in vitro. Amplicons were produced in all species. After the amplicons were digested by HaeIII, two fragments was made in Candida species, four in Aspergillus species, three in cryptococcus species. Collectively, the PCR- RFLP is a sensitive, specific, and fast method for detection of the medically important fungi.

Key words Polymerase chain reaction(PCR) Restriction fragment length polymorphism(RFLP) Candida Aspergillus Cryptococcous

医院内感染是住院患者的重要并发症。其中真菌感染的发 病率虽尚低于细菌感染，而居第二位，但死亡率更高，因此早 期诊断治疗十分重要。一个理想的深部真菌诊断方案除应能 达到快速、敏感性高及特异性强要求外，还应能区别菌属。因 为不同菌属的真菌感染用药存在差别，如念珠菌感染应首先 考虑氟康唑，而曲霉感染以两性霉素B(脂质体)治疗为主。因此 ，我们在设计的真菌特异性通用引物聚合酶链反应(PCR)系统的 基础上^[1]，进一步建立PCR-限制性内切酶长度多态性(RFLP)以 鉴别3种常见的致病性真菌(念珠菌、曲霉和隐球菌)感染。现报 告如下。

1材料与方法

1.1菌种：菌种未注明来源者均由中国微生物菌种保藏理委 员会医学真菌中心(CCCCMID)提供。白念珠菌3株(其中两株分别由 美国Duke大学及Iowa大学惠赠)，克柔念珠菌(J931312)、季也蒙念珠 菌(J941267)、近平滑念珠菌(B66126)、热带念珠菌(CDC44)和乳酒念 珠菌(B46120)各1株(均由比利时医学真菌中心惠赠)，新生隐球菌 格梯变种(NIH18，血清型C)、新生隐球菌新生变种(NIH52，血清型 D)、罗伦隐球菌、烟曲霉和杂色曲霉各1株。

1.2菌液制备：从沙氏培养基上取单个菌落，转种入5mL的酵 母提取液中。24小时(酵母菌)或72小时(曲霉)振荡培养，离心弃 上清后加0.5mL山梨醇缓冲液^{[0.9M山梨醇，0.1MTris·Cl(pH8.0),0.1ME DTA]}，混匀后－20℃保存。

1.3真菌DNA提取：采用酶解破壁法。简要如下，解冻后加入5 0μL0.28M2-巯基乙醇(AMRESCO)和6U消解酶(Lyticase,Sigma)，混匀后 37℃孵育1小时。离心弃上清加0.5mLTris/EDTA液^{[50mMTrisCl(pH8.0)， 20mMEDTA]},混匀后再加入50μL10％SDS,65℃孵育20分钟。加200μL5 M醋酸钾后置冰上1小时。酚/氯仿/异戊醇抽提后，加2倍体积无 水乙醇并离心，弃去上清后干燥。加300μL含0.05mgRNA酶的TE缓冲液，37℃孵育1小时。－20℃保存。

1.4热启动PCR：反应体系中总体积50μL。其中含dNTPs(SABC)各20 0μmol/L、MgCl21mmol/L、引物(由UNCHospitals合成)各0.2pmol/mL、10×P CR缓冲液(Promega)5μL、TaqDNA聚合酶(Promega)1.5u、模板DNA1μL。 使用我们合成的一对引物(NS5和NS6)，扩增真菌18SrDNA上的一段3 10bp的保守片段，NS5AACTTAAAGGAATTGACGGAAG；NS6GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 。将除TaqDNA聚合酶以外的其它成分充分混匀，在基因扩增仪2 400(PerkinElmer)上加热至80℃时加入TaqDNA聚合酶，按以下条件扩 增：94℃充分变性6分钟后，以94℃1min、58℃2min、72℃3min。循环 30次后，72℃充分延伸10分钟。取10μL水相扩增产物作2％琼脂 糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波透射式紫外线观察、照相。 分子量标志(SABC)采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照 物片段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237bp。

1.5RFLP：经对GeneBank检索，念珠菌、隐球菌和曲霉扩增产物 的序列有所不同，其中分别存在1个、2个和3个限制性内切酶Ha eIII的酶切位点。取5μLPCR扩增产物、13μL灭菌水和2μL10×限 制性内切酶缓冲液(SABC混合后，加入10UHaeIII(SABC)，37℃孵育1 小时，再加入1μL0.5MEDTA终止反应。

1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶面积约为40cm×20cm，厚度为0. 5mm。30％丙烯酰胺^{[丙烯酰胺(SABC)29g，N，N’-亚甲双丙烯酰胺 (Serva)1g，加水至100mL]}40mL、水39.3mL、5×TBE20mL、10％过硫酸铵( AMRESCO)0.7mL及35mLTEMED(AMRESCO)配制12％聚丙烯酰胺凝胶。将酶切 产物与6×上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合，加 入聚丙烯酰胺凝胶中，300V电泳5小时后，在含0.5μg/mL溴化乙 锭的1×TB缓冲液中染色1小时。中波透射式紫外线观察、照相 。

1.7体外实验：选择热带念珠菌和新生隐球菌格梯变种，用 生理盐水将其浓度用血细胞计数器调整为5，10，2×10，2×10² ，2×10³和2×105。采集正常人血，WBC5.4×109/L，RBC3.84×1012， 中性粒细胞占0.64，淋巴细胞占0.35，嗜酸性粒细胞占0.01。将等 量菌液和血混合。红细胞和血细胞裂解通过加含0.05％蛋白酶 K和0.05％吐温20的TE缓冲液至菌血。再加入2.5mg/mLDNA酶，混匀后 37℃孵育15分钟。随后离心收集真菌孢子，进一步基本按实验 步骤1.3～1.6。

1.8图像分析采用1D软件(SELEquipmentCo.Ltd)对图像进行分析。

2结果

2.1PCR结果：11种14株常见致病真菌均扩增出310bp的特异性片 段(见图1)。

2.2PCR-RFLP结果：念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物的聚丙烯 酰胺凝胶电泳，分别存在1个、3个和2个特异性酶切位点，片段 大小符合预测的结果(见图2)。

2.3体外实验结果：血中感染模型中，部分最低可检测出10～ 200CFU菌体(见图3)。在我们的研究中，未见血对PCR-RFLP结果产 生影响。

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图1部分致病真菌PCR扩增结果：M为分子量标志(SABC)

采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照物片

段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237

bp。1为烟曲霉；2为季也蒙念珠菌；3为乳酒念珠菌； 4

为新生隐球菌格梯变种；5为克柔念珠菌；6为黄曲霉 ；

7为白念珠菌

图2部分念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物HaeⅢ酶切后的

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果M为Pgem-3Zf/HaeⅢ分子

量标志(SABC)参照物片段分别为587bp、458bp、434

bp、323bp、314bp、289bp、267bp、174bp、142bp、10²bp、

80bpt和11bp。1为白念珠菌扩增产物；2为黄曲霉；

3为新生隐球菌格梯变种；4为乳酒念珠菌；5为白念珠

菌，2～5为酶切产物

图3热带念珠菌体外PCR敏感性实验结果，M为分子量标

(SABC)同图2。1～6分别为5，10，2×10，2×10²，

2×10³和2×105CFU

3讨论

基因诊断被公认为实验诊断发展方向。有专家认为，实验 诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正<