中国医学科学院学报1999年第21卷第1期

尹跃平铃木定彦^*牧野正直^*吴勤学

摘要目的用现代分子生物学技术即基因工程手段制备麻风杆菌抗原。方法用原位斑点杂交法筛选阳性克隆，并对其中一株约3000bp的DNA片段进行酶谱和DNA序列分析。结果从本实验组制备的麻风杆菌基因文库中筛选出2株含α2抗原的基因片段，并建立了α2抗原基因在大肠杆菌中的表达体系，在XLI-Blue菌株中大量表达出易于提纯的α2重组融合蛋白抗原，经麦芽糖亲和色谱柱提纯后，每200ml转化宿主菌培养液可获得10mg重组融合蛋白。结论α2重组融合蛋白抗原的制备对于探讨麻风病的发病机制、建立麻风病和其它抗酸杆菌疾病(如结核病等)的高度特异性血清学诊断方法都有意义。

关键词：麻风杆菌α2抗原基因克隆重组抗原

自从1873年挪威科学家韩森发现麻风杆菌以来，虽经过几代科学家的不懈努力，仍未能解决麻风杆菌的体外人工培养问题，目前仅能在极少数几种动物，如：裸鼠，九带犹狳，恒河猴^［1，2］等体内进行有限繁殖。因麻风菌的来源极为困难，无法得到大量的纯麻风杆菌及其抗原，大大影响了探讨麻风病的病因病理、建立血清学诊断方法以及进行疫苗开发等工作。为解决这一难题，本研究探讨用现代分子生物学技术即基因工程手段制备麻风杆菌抗原的方法。

α抗原为抗酸分枝杆菌的主要分泌蛋白之一，研究发现该抗原有一个基因家族，目前已知有3个结构相似的基因。且对抗酸分枝杆菌感染患者体内的T细胞及B细胞有较强的抗原性^［3，4］。本工作从麻风杆菌基因文库中克隆筛选出α2抗原的基因，对该基因进行了DNA序列分析以及在大肠杆菌中表达的研究，结果如下。

1材料和方法

麻风杆菌DNA的制备麻风杆菌(Mycobacterium leprae,ML)为接种在裸鼠足垫上的TAI53株增殖菌，由日本多摩研究所高坂博士惠赠。MLDNA按文献［5］方法制备，即用玻璃珠振荡法破菌释放MLDNA后，用酚/氯仿提取纯化备用。

载体与菌株载体DNA均购自日本第一化学社，pUC18、pUC19及M13为克隆用载体，pMALc-RⅠ为表达用载体；基因克隆用菌株Y1088、Y1090，DNA扩增制备用菌株TB1，蛋白表达用菌株XLI-Blue为日本大阪公众卫生研究所病理室冻存。

主要试剂本实验所用酶均购自日本宝酒造公司；化学试剂均购自日本和光纯药制造公司；测序用DNA提纯试剂盒及双脱氧DNA测序试剂盒为美国Pharmacia LKB Biotechnology公司产品；蛋白测定试剂盒为美国Coomassie公司产品。

α2抗原基因的克隆筛选用原位斑点杂交法^［6］从麻风杆菌基因文库(为本研究组构建)中筛选出阳性克隆。将阳性克隆株的DNA扩增提取后，插入到质粒载体pUC18上，通过转化宿主菌XLI-Blue、大量制备纯化重组DNA；在自动DNA测序仪(Pharmacia LKB Biotechnology)上对每个阳性克隆株的DNA两端进行部分测序，以筛选目的DNA片段；测序采用双脱氧链终止法，反应严格按DNA测序试剂盒说明操作。

酶谱分析选择一株长约3000bpDNA片段的阳性克隆，按文献［5］方法扩增提纯DNA，用15种限制性内切酶进行酶谱分析，制备酶切图谱。

DNA测序根据酶切图谱，选择供测序用载体的克隆酶切位点，用限制性内切酶切为9段，再分别重新接到测序用载体pUC18、pUC19及M13上；按测序用DNA提纯试剂盒说明书提纯DNA(ODIE系统，美国Pharmacia公司)，再按双脱氧DNA测序试剂盒说明的方法，在自动DNA测序仪上对组成α2抗原基因全长的9段DNA进行测序。

α2抗原基因的表达

PCR法扩增α2抗原基因DNA片段：引物根据α2抗原基因DNA序列设计，并在5′和3′端分别设计了EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点。模板DNA为从麻风杆菌基因文库中筛选克隆出的含编码α2抗原基因的约3kb的DNA片段。扩增反应在Zymoreactor(AttoCo)热循环仪上进行。反应条件为：变性：92℃1min,退火：60℃1min，聚合：72℃2min，共35个循环。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA提取试剂盒从琼脂糖凝胶上提纯DNA。按文献［4］方法转接、扩增和提纯DNA后，再进行一次DNA测序，以确认系α2抗原基因DNA片段。

α2抗原基因在大肠杆菌中的表达：α2抗原基因表达载体为质粒pMALc-RⅠ,此质粒的表达产物为与麦芽糖有亲和力的重组融合蛋白(即含有malE基因)，将便于表达的产物提取纯化。该表达载体的转化及诱导方法如下：取含有目的DNA片段的重组质粒pMALc-RⅠ转化宿主菌菌落，分别接种到5mlLB培养液中，37℃培养过夜后，取2ml再转接种到200mlLB培养液中，37℃振荡培养至在600nm波长的吸光度值为0.5，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖)诱导剂至最终浓度为0.5mmol/L，继续37℃振荡培养，同时每隔1h取出0.5ml培养液，经SDS-PAGE电泳检测表达蛋白含量，以确定最佳表达条件。

表达重组蛋白的提取与提纯：将最佳表达条件下的培养液离心集菌后，重新悬浮于20ml的L缓冲液(10mmol/LH₃PO₄，30mmol/LNaCl,0.25%Tween20,10mmol/Lβ-巯基乙醇，10mmol/LEDTA,10mmol/LEGTA)，冷冻融化，再用超声波粉碎器(BioruptorUCD-200T,日本东湘电器社制)破碎细胞后，加入最终浓度为0.5mol/LNaCl，9000×g4℃下离心30min,取上清用麦芽糖亲和色谱柱进行提纯。洗脱液为含10mmol/L麦芽糖的C缓冲液(10mmol/LH₃PO₄，0.5mol/LNaCl,1mmol/LNaN₃，10mmol/Lβ-巯基乙醇，10mmol/LEGTA)。提纯的蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度，并用蛋白测定试剂盒检测提取蛋白的相对含量。

2结果

新抗原基因的筛选及命名从麻风杆菌基因文库中共筛选出9株阳性克隆(图1)，其中有两株克隆经部分DNA序列测定显示与α1抗原基因有76%的同序性，表明为α抗原基因家族的一个新成员，本组将此命名为α2抗原基因。

图19株麻风杆菌基因文库阳性克隆的Southern印迹杂交分析

Fig 1Southern blot hybridization analysis of the 9 positive clones from genomic library probe

M.leprae α1 antigen DNA fregment labelled by digoxig enin-11-dUTP;

Lane 1: DNA marker (λDNA/Hind Ⅲ and pUC118/HinfⅠ)；

Lane 2～10:clone 1～9

α2抗原基因DNA片段的酶切位点通过对15种限制性内切酶酶谱分析(图2)，得到了含α2抗原基因DNA的长约3000bpDNA片段的酶切图谱，并从中确定出10个可用于DNA测序的酶切位点。

图2重组麻风杆菌α2抗原基因DNA限制性酶切图谱

Fig2Restriction map of recombinant α2 antigen gene (1% agarose gel)

Lane 1: DNA marker (λDNA/Hind Ⅲ and pUC118/HinfⅠ)；Lane 2: Xho Ⅰ+EcoR Ⅰ；Lane 3: Xho Ⅰ+Pst Ⅰ+EcoR Ⅰ；Lane 4:Pst Ⅰ+EcoR Ⅰ； Lane 5:Xho Ⅰ+EcoR Ⅴ+EcoR Ⅰ； Lane 6:Sma Ⅰ+EcoR Ⅴ+EcoR Ⅰ； Lane 7: Sma Ⅰ+Pst Ⅰ+EcoR Ⅰ;Lane 8: Sma Ⅰ+Xho Ⅰ+EcoR Ⅰ; Lane 9:Kpn Ⅰ; Lane 10: KpnⅠ+EcoR Ⅰ

α2抗原基因的氨基酸序列经DNA测序，得到全长为986bp的α2抗原基因DNA片段(此DNA序列已登录在国际联网的DNA数据库GSDB/DDBJ/EMBL/NCBI中，登录编号为：D43841)，并据此DNA序列推测出α2抗原氨基酸序列(图3)。

图3重组麻风杆菌α2抗原基因的DNA序列和推测的氨基酸序列

Fig3The deduc ed amino acid sequence are shown under the nucleotide sequence using the standar d one-letter abbreviation the underlined part represents the putative signal sequence; potential ri bosome-binding sequences are indicated by SD(Shine-Dalgarno); the putative pro moter sequences are indicated by-10 and -35

各种α抗原氨基酸序列比较通过对各种α抗原氨基酸序列比较，麻风杆菌α2抗原与α1抗原以及结核菌85A、B，BCG85A、B之间的同序性分别为74.3%、85%、78%、84%和76%。并显示有特异表位的存在(图4)。