关键词： 色谱法，液相；高速逆流；白果内酯；分离和提纯；橙皮甙；分离和提纯

摘要：首次应用HSCCC获得白果内酯和橙皮甙纯品。白果内酯经TLC，HPLC/RI，MS(E1)和IR谱鉴定，橙皮甙经HPLC/UV和TLC鉴定，均达到定量用对照品的纯度和含量要求。表明HSCCC是制备性分离中草药对照品的一种简捷实用的新手段。

中图分类号：R284.2文献标识号：A文章编号：1003-9783(1999)06-0364-03

Preparative Separation and Purification of Authentic Pure Compounds of Bilobalide and Hesperidin by HSCCC

CAI Ding-guo,SHE Jia-hong,LIU Wen-yong, et al

(Naval Research Center of Pharmacy, Shanghai 200083)

Abstract:As a liquid partition chromatographic system free of solid support matrix in the separation column, high-speed countercurrent chromatography (HSCC) was successfully applied to the separation of two authentic pure compounds for the first time.Bilobalide was isolated from Ginkgo Biloba Extract (GBE) and Hesperidin was purified from crude extraction of pericarp of Citrus reticulata Blanco, which can be used as reference standard of the analysis for Chinese herbal medicine.The results indicate that the HSCCC is an ideal technique for separating preparation of authentic pure compounds from medicinal plants.

Keywords:Bilobalide/isolation and purification; Hesperidin/isolation and purification;@ High-speed countercurrent chromatography (HSCCC)

中药化学对照品是中药质控指标成分鉴别和含量测定必不可少的标准物质。中国药典95版一部收载对照品143种；中药材和中成药方剂共920种，平均6.4种原料药材和制剂仅有1种对照品拟用于质控。与银杏叶单味药制剂国际公认质控采用近10种对照品比较而言，其比例差距甚大。而且许多常用对照品往往供不应求或缺如。这对于采用多种指标成分以提高质控水平，开发国际认可并能合法进入国际医药市场的现代中药，则更难以满足需求。

作为标准物质，中药化学对照品应具有高度均匀性，量值准确性和良好稳定性。尤其含量测定用的化学对照品，对其纯度要求非常严格，含量规定在98%以上，分离纯化的技术难度甚大。制备型HPLC是国外常用的主要手段，其设备和载体填料价格高，对样品前处理要求严格，存在不可逆吸附，有机溶剂用量很大而难以承受。国外仅有少数厂家生产销售天然物对照品和少量的中药化学对照品，价格十分昂贵。近年来，我们致力于拓展具有制备性分离并同步完成纯化特点的高速逆流色谱法(HSCCC)，应用于中草药对照品研制并推进产业化。之前已完成银杏叶黄酮醇甙元，马钱子生物碱和毛地黄毒甙对照品^［1～3］。本文报道白果内酯和橙皮甙对照品的实验结果。

1白果内酯分离鉴定

1.1样品制备与银杏总内酯TLC检测

1.1.1银杏叶粗提物来自江苏银杏叶原料产地某药厂。采用酸性氧化铝柱层析富集银杏总内酯。

1.1.2TLC检测采用硅胶H-CMCNa自制薄层板并以醋酸钠改性^［4］。取银杏总内酯以甲醇溶解制成每mL含lg银杏叶粗提物的样品液，点样10μL；取对照品银杏内酯A(甲)、B(乙)、C(丙)和白果内酯(丁)以甲醇溶解制成对照液每mL含1mg，点样2μL。由甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(4：6：2.7：0.8)为展开剂，上行展距10cm，晾干，醋酐熏20min，160℃烘30min,UV365nm下银杏总内酯呈亮黄色荧光斑点与对照品相应斑点的Rf值分别为(甲)0.28，(乙)0.46，(丙)0.54和(丁)0.65相一致。

1.2HSCCC分离纯化

1.2.1仪器：89-A型HSCCC(北京市新技术应用研究所)，进样阀2mL。

1.2.2白果内酯的分离纯化HSCCC溶剂系统由氯仿-甲醇-水(4：3：2)组成，充分混合后分取下相溶剂为流动相，上相溶剂为固定相，保留值79%。取银杏内酯以流动相溶剂溶解配制样品液每mL含银杏粗提物1g，按常规上机条件^［5］，主机正转800rpm,进样2mL，流动相由首端向尾端洗脱，流速2mL/min，从进样品后50min开始定时收集溜份，TLC鉴测，收集合并白果内酯溜份。连续进样3次，得量10mg。

1.3白果内酯纯品鉴定

1.3.1HPLC测定由上海市中药研究所代测，得HPLC/RI谱见图1。结果显示Rt3.5min前为溶剂峰，Rt5.4min呈现对称单峰为白果内酯。

图1白果内酯(纯品)的HPLC/RI谱

Rt3.5min前为溶剂峰，

Rt5.4min白果内酯峰

1.3.2MS(EI)测定采用J.MS-300型质谱仪测定分子离子峰和主要碎片(m/z)：327(M⁺+1)，326(M⁺)，270(M-56)，196(M-129)，178(M-12-H₂O)，129(C₄H⁺₉CO₂+CO)，121，57(B⁺，C₄H₉)，44(CO₂)，41与文献^［6,7］一致。

1.3.3IR的测定采用FT-IR5DX红外光谱仪(美国Nicolet公司)测定IRKBrcm^-1：3450(羟基)，1800，1780，1760(r-内酯)与文献^［6］一致。

1.3.4与国家标准样品比较本法所得白果内酯上述HPLC/RI，IR，MS与上海中药研究所提供的白果内酯标准图谱一致。

2橙皮甙分离鉴定

2.1样品制备及TLC鉴定

2.1.1样品制备取陈皮粗粉100g，以95%乙醇回流提取4次得提取液1500mL，室温放置过夜，上清液减压浓缩至200mL，冰箱放置过夜，分取清液，加水50mL稀释，加入乙醚萃取，析出沉淀，水洗，抽滤，干燥，得粗品4g。

2.1.2TLC鉴定按中国药典95版一部159页陈皮TLC鉴别项，样品以含橙皮甙为主。

2.2HSCCC分离纯化

2.2.1仪器同上，检测器为57WAUVSD(上海光学仪器厂)，进样阀2mL。

2.2.2HSCCC分离纯化由氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)配制成溶剂系统。取上相溶剂加入适量氨水溶解样品，配制每mL含5.2mg样品的溶液。操作同上。以下相溶剂为固定相，主机反转800rpm，进样2mL，流动相由尾端向首端洗脱，流速2.0mL/min。UV286nm检测，1h内完成分离得3个波峰，峰2经TLC检测为单一班点与纯品橙皮甙一致。连续进样3次共得橙皮甙20mg。HSCCC/UV谱见图2。

图2陈皮粗提物HSCCC/UV谱

2.3橙皮甙纯品HPLC鉴定

2.3.1仪器型号：岛津6A高效液相色谱仪，SPD型UV检测器，CR-3A数据数理机。C18柱150mm×6.0mm。

2.3.2HPLC测定参照文献^［8］条件，由甲醇-水(45∶55)配制流动相，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长288nm，取HSCCC峰2溜份直接进样20μL，结果显示Rt7.35min单峰为纯品橙皮甙，HPLC/UV谱见图3。

图3橙皮甙纯品HPLC/UV谱

3讨论

应用HSCCC分离纯化白果内酯未见文献报道，本文首次应用于银杏叶粗提物的实验，表明其制备性分离纯化效果在2h内获得的纯品白果内酯，已达到定量用对照品的要求。

橙皮甙对照品已收载中国药典，现有分离纯化方法较难满足要求。本文首次采用HSCCC直接从陈皮粗提物进行制备性分离，90min内获得橙皮甙纯品达到定量对照品要求。为制备橙皮甙对照品提供了一种简捷实用的新途径。

样品溶液浓度与纯品得量直接有关。经本文试验改进，白果内酯样品溶液浓度可提高10倍以上。橙皮甙样品溶液有待进一步实验，以便达到小批量制备。

参考文献：

［1］蔡定国，缪平，顾明娟.高速逆流色谱法从银杏叶分离异鼠李素，山奈酚和槲皮素对照品［J］.中药新药与临床药理1999，10(1)：44.

［2］P.Miao,DG.Cai,BR.Xiang,DK.An & Y.Ito,Separation and purification of strychnine from crude extract of strychnos nux-vomical by High-speed countercurrent chromatography［J］. J.Liq.Chrom.& Rel Technol,1998,21(1&2),163～170.

［3］缪平，蔡定国，相秉仁，等.应用高速逆流色谱分离纯化洋地黄毒甙［J］.中药新药与临床药理1995,6(4):