关键词： 随机扩增多态性；DNA；技术；利用；中药鉴别

摘要：以各地产西洋参为研究对象，对影响中药材随机扩增多态性 DNA (RAPD) 的若干问题进行探讨。研究发现，中药材 DNA 模板的降解程度、纯度、浓度，Tap 酶的浓度， Mg²⁺浓度以及循环参数等诸多因素皆会不同程度的影响扩增结果，同时推荐一个较为适用的循环参数。

分类号：R282.5；Q503；Q281

文献标识码：A

RAPD^［1］ 是一种以 10 bp 左右的短寡核苷酸为引物的 PCR (聚合酶链式反应)技术，由于 RAPD 无需知道被检样品的基因组序列，具有灵敏、简捷和对模板要求不高等特点，已经被广泛应用于物种的遗传进化、分类等方面。随着该技术的发展，近几年已用来鉴别中药材^［2～4］，显示了良好的应用前景。然而在不同的报道中 RAPD 其最佳扩增条件有些出入。为了使 RAPD 结果在不同实验实具有重复性和可比性，提高 RAPD 技术在中药鉴别中的应用价值，根据我们实验的实际应用，对上述易影响 RAPD 的诸多因素进行了较为详细的论述。

1材料和方法

1.1中药材样品采用各地产的西洋参作为样品(全部样品均为干品，由广州市药品检验所谢培山教授赠送)。

1.2试剂Tris(B.M.),β-巯基乙醇(ナカライテスク株式会社)， SDS(Serva)，PVP(聚乙烯吡咯烷酮，BASF)，Marker(MBI)，牛血清白蛋白 (BSA)(Sigma)，Tap 酶、引物(上海 Sango),琼脂糖(Promega)，玻璃砂(自制)；其?余?试?剂?均?为?国?产?分?析?纯。

1.3主要仪器低温高速离心机(Beckman GS-15R)；紫外/可见光分光度计(Pharmacia 4000)；凝胶成像自动分析仪(UVP GDS 7600G)；低温恒温式电泳仪 (LKB)；PCR 仪(PE 2400)；纯水仪(Millipore Q-R)。

1.4DNA 提取采用改良的低 pH 法^［5］。

1.5DNA 扩增 PCR 在 PE2400 PCR 仪上进行，反应体积为 25 μL。其成分为：Mgcl₂2.5μL(25 mmol/L)，引物 2μL(5μ mol/L)，BSA 1μL(25 g/L)；4 种 dNTP 0.25μL(10 mmol/L)， 10×buffer 缓冲液 2.5μL( 无 Mg⁺⁺)，2.0U Taq酶，50 ng 样品，加入超纯水至 25μL。循环参数为 94℃，3 min；随后 94℃，1 min；39℃，45 s；72℃，60s；35个循环。最后 72℃，3 min (注：文章中若无特别指明均为此循环参数。)

2结果和讨论

2.1模板(中药材提取的总 DNA)

2.1.1模板纯度从图 1 可看出，模板 A260/280 在1.1～2.0 之间其 PCR 结果基本相同。分子生物学的各类研究，通常需获得高纯度的 DNA，然而在中药材的 RAPD 研究中，当模板中含有一定量的杂质时，并不影响扩增结果。我们在研究中发现陕西陇县、洋县产西洋参、云南田七、西班牙红花等经过粗提后仍然含有较多的杂质并明显含有色素，仍能进行扩增且其 DNA 指纹图与纯化后的指纹图一样。中药材品种繁多，相当一部分样品经过多种方法纯化后仍含有未知的杂质，但并不影响 PCR 反应。

图1各地产西洋参不同纯度 PCR 结果

A260/A280 值分别为 1.1.13(辽宁中药研究所 92 年产)；2.1.14(吉林农业大学 94 年产)；3.1.32(吉林中国农科院 93 年产)；4.1.15(山东烟台 94 年产)；5.1.53(北京怀柔 92 年产)；6.1.58(北京怀柔 94 年产)；7.1.73(河北平泉 92 年产)；8.1.76(山东莱阳 94 年产)；9.1.88(陕西西安 94 年产)；10.2.03(陕西陇县 92 年产)。引物为 S359 GGACACCACT

图2模板浓度和 BSA 对 PCR 的影响

(样品为 92 年产辽宁西洋参)

模板浓度为 1.3.125ng；2.6.25ng；3.12.5ng；4.25ng；5.50ng；6.100ng。BSA 浓度为 7.不加 BSA；8.0.5(g/L)BSA；9.1.0(g/L)BSA；10.2.0(g/l)BSA。引物 S22 TGCCGAGCTG

2.1.2模板浓度PCR 有一定影响，但在一定范围内其扩增结果基本相同，如图 2 所示，从 3.125～100 ng其 DNA 指纹图基本一致。关于 RAPD 的最佳浓度有关报道不一^［6、7］。从我们对多种中药材的扩增结果来看，各样品的最佳扩增浓度并不完全相同，但大多在 20～50 ng。

通常模板反应量由 A260×50/1000×稀释倍数来确定，此公式适用于 A260/A280 在1.7～2.0之间。中药材品种繁多，各药材化学成分差异较大，经过纯化的模板会带有不同的杂质且难于去除，某些杂质在 UV260 处也有吸收峰，此时若以上述公式来进行定量其偏差是较大的。如我们在提取陕西留坝产西洋参时，经粗提后其 A260 OD 值为 0.532 (A260/A280为 1.213)，而进一步纯化后，OD 值则减少至 0.142 (A260/A280 为 1.842)，所以 A 260 在本研究中仅能作为一个参考。值得注意的是，用低 pH 法得到的多种不同纯度的中药材 DNA 往往不能直接用于扩增，须将原液稀释 10～80 倍(在有效扩增浓度范围内)后方可进行有效扩增，说明按上述方法提取的 DNA 有?干?扰 PCR 扩?增?的?抑?制?物?存?在。

2.2反应介质 BSA 能影响扩增结果，如图 2 所示，不加 BSA 虽能进行扩增，但其条带数少于加入 BSA 的反应且不甚清楚。 BSA 浓度在 0.5～2.0g/L 其条带基本一致。陈氏^［6］等认为，在反应物中加入 BSA 或明胶能使 RAPD 条带数明显增加，不加 BSA 或明胶扩增的片断数明显减少，甚至不扩增。王氏^［8］在扩增龟板及鳖甲时，用各种方法甚至 PROMEGA 的纯化试剂盒均不能去除反应中的抑制物，但加入 BSA 后则获得了较好的扩增。为保证反应的顺利进行及有效扩增，我们建议在 PCR 反应中加入 BSA 或明胶。

根据我们的经验，中药材的 RAPD 扩增 Taq 酶通常须 1.5U/25μL 以上方能进行较好扩增，这可能与各厂家 Taq 酶活性和我们提取的模板中带有某些抑制成分有关。Mg²⁺、dNTP 扩增结果影响不大，主要是对某些弱带有影响。

图3各地产西洋参总 DNA 电泳结果

1.辽宁中药研究所( 92 年产)2.吉林农业大学( 92 年产)；3.山东烟台 ( 92 年产)；4.加拿大多伦多( 91 年产)；5.加拿大多伦多( 93 年产)；6.美国威斯康星 (92 年产)；7.美国威斯康星 ( 92 年产)：8.山东莱阳( 93 年产)；9.北京怀柔( 94 年产)；10.北京怀柔( 94 年产；11.陕西留坝 ( 95 年产)；12.陕西洋县 (95 年产)；

图4各地产西洋参 PCR 指纹图

样品产地和采摘年份同图3，引物 S45 TGAGCGGACA

2.3引物的筛选问题商品中药材基因组 DNA 降解程度差别较大，但合适的引物可得到基本一致的 DNA 指纹图谱， 如图 3 所示，各地产西洋参由于采摘年代及存放条件不一，各样品降解程度不同，但用 S45 引物进行扩增 ，1～9、11、12 号样品都能得到基本相同的 DNA 指纹图 (图 4) 。我们认为，应尽量选择能使模板在小分子片断有优势扩增、主条带少、清楚且易重复的引物。通常 RAPD的产物在 200～3000 bp 形成指纹图，但能使中药材扩增出 200～1500 bp 条带的引物较为适合，因为在此范围内，不同时间样品易出现相同条带即重现性好。中药材中 DNA 降解程度相对较小的样品易有高分子量产物，如图 4 第 10 孔，其 2000 bp 有一明显扩增条带。若以此条带作为鉴别的依据，则有可能导致假象。

图5西洋参不同降解程度的总 DNA 电泳图

1.陕西西安 ( 92 年产)：2.辽宁中药研究所 ( 94 年产)；3.吉林中国农科院 (95 年产)；4.吉林农业大学 (96 年产)；5.北京怀柔( 94年产)：6.河北平泉( 95 年产 )。

图6不同降解程度模板 RAPD 指纹图

样品产地和采摘年份同图5。1～6 循环数为 35。7～12 循环数为 40，样品同 1～6。引物 S359 GGACACCACT

2.4扩增条件在其他参数条件相同时，样品 DNA 降解相对较为严重的模板，在用某些引物扩增时，反应循环数要适当增加，才能得到有效扩增。如图 5 所示，1、2、3、4 号样品降解度较 5、6 大，当扩增条件为 35 个循环时，不能得到有效扩增 (图 6，1～4) ，而将循环数增至 40 个循环时，扩增较