摘要用高效液相色谱法(HPLC)测定人血清中地尔硫(DZ)及去乙酰地尔硫(M₁)浓度。以Spherisorb ODS,5μm为层析柱,流动相:甲醇∶乙腈∶水(60∶10∶30),检测波长237nm,以盐酸普罗帕酮为内标。检测范围:DZ为5.45～272.5ng·ml^-1,M₁为5.85～292.5ng·ml^-1。最低检测浓度:DZ为2.87ng·ml^-1,M₁为1.99ng·ml^-1。平均回收率DZ为101.88%,M₁为101.72%,RSD均在12%以内。并对4名受试者口服90mg盐酸地尔硫片后,其药时曲线经微机用PKBP-N1程序拟合,DZ为一房室开放模型,M₁为二房室开放模型,求得DZ和M₁的T_1/2分别为5.6±1.5h和14±7h。

The pharmacokinetic studies of diltiazem and its major active metabolites in human by HPLC

Tan Hengshan,Yang Je,Cai Minghong,et al

(General Hospital of Nanjing Armed Forces,Nanjing 210002)

A HPLC method for simultaneous determination of diltiazem(DZ) and its major metabolite desacetyldiltiazem (M₁) in human plasma was described using SPHERISORB ODS 5μm analytical column for separation.An aliquot of the aqueous acid phase was chromatographed using methanol-acetonitrite-water (60∶10∶30) containing 0.08% acetic acid and 0.04% triethylamine as mobile phase.The wavelength used for detection was 237nm.The propafenon was used as the internal standard.The detection ranges were 5.45～272.5ng·ml^-1 for DZ and 5.85～292.5ng·ml^-1 for M₁.The methods are highly sensitive with limits of detection at 2.87ng·ml^-1 for DZ and 1.99ng·ml^-1 for M₁ respectively.The recoveries were about 101.88% for DZ and 101.72% for M₁ respectively.The RSD values of within-day and between-day were all lower than 12%.After 4 healthy volunteers received 90mg diltiazem tablets,the time curves of concentration in plasma were fitted by PKBP-N1 program.DZ was fitted to a one compartment open model.M₁ was fitted to a two compartment open model.The results showed that T_1/2 of DZ and M₁ were 5.63±1.48h and 14.49±7.08h respectively.

Key wordsdiltiazem,pharmacokinetics,HPLC

盐酸地尔硫是一种新的钙通道阻断剂,是治疗心绞痛、高血压等心血管疾病的首选药物之一。有关地尔硫的血药浓度测定方法,国内已有报道^［1-3］,但对其主要代谢产物-去乙酰地尔硫的药物动力学研究未见报道。本文建立了一种HPLC法同时测定人血清中盐酸地尔硫(DZ)和去乙酰地尔硫(M₁)浓度的方法,并进行了DZ和M₁的药物动力学研究,结果报道如下。

1实验方法

1.1仪器和试药LC-6A高效液相色谱仪(日本株式会社岛津制作所),FCV-2AH高压流路切换阀,SPD-6AV紫外检测器,SCL-6B控制器,CR-6A数据处理机。盐酸地尔硫对照品(杭州民生药厂提供),去乙酰地尔硫对照品(上海淮海制药厂提供)。合心爽(盐酸地尔硫)片剂30mg dZ/片(日本田边制药株式会社,批号44034)。盐酸普罗帕酮注射液3.5mg·ml^-1(上海信谊药厂,批号920802)。甲醇、乙腈、正己烷、异戊醇、冰醋酸和三乙胺均为分析纯试剂。

1.2色谱条件和血样处理^［4-6］

1.2.1色谱条件采用日本岛津LC-6A高效液相色谱仪,色谱柱:Spherisorb ODS,5μm,4.6×250mm(大连化物所提供);流动相:甲醇∶乙腈∶水(60∶10∶30),内含0.08%冰醋酸,0.04%三乙胺,使用前过滤,超声脱泡。检测波长237nm,流量1.0ml·min^-1,检测灵敏度0.001,纸速1mm·min^-1,进样体积20μl。

1.2.2血样预处理取1.0ml血清,加内标10μl(盐酸普罗帕酮28μg·ml^-1),再加正己烷∶异戊醇(98∶2)混合溶剂每次4ml,提取两次。每次振荡3min,离心(3000r·min^-1)5min,合并有机层。取7ml提取液,加0.01mol·L^-1盐酸100μl,充分振摇30次,离心(3000r·min^-1)5min,弃去有机层,水层取20μl进样。

1.2.3DZ和M₁的血清标准曲线配制于空白血清1.0ml中加入内标10μl,再加入DZ和M₁标准液,使其浓度分别为:DZ 5.45,10.9,27.25,54.5,109.0,163.5,272.5ng·ml^-1;M₁ 5.85,11.7,29.25,58.5,117.0,175.5,292.5ng·ml^-1。按血清预处理方法处理后进样。分别以DZ和M₁的浓度对色谱峰高比Y(H_DZ/H_内)和Y＇(H_M1/H_内)进行回归计算,得到血清标准曲线方程。

1.2.4回收率取4种不同浓度(DZ:10.9,54.5,109.0,163.5ng·ml^-1;M₁:11.7,58.5,117.0,175.5ng·ml^-1)的血清样品,按血清预处理操作,每个浓度做8次,用实测值与理论值之比计算回收率。

1.2.5精密度试验用4种不同浓度的DZ和M₁血样,按血样预处理测定峰高比,每种浓度连续进样5次,得日内差;4种浓度在2周内测定7次,得日间差。

1.2.6干扰实验因临床上往往合并用药,所以我们预试了30多种有关的心血管药物干扰试验,考察本法的专属性。

1.3人体试验

1.3.1受试者4名年轻健康男性,具有标准体重,血尿常规和肝肾功能以及心电图均属正常。2周前未用其它药品,服药前空腹12h以上,服药后4h进统一餐,试验期间可饮水,禁酒、茶和吸烟。

1.3.2血样采集口服合心爽90mg,分别于0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,8,10,12,24h静脉采血3ml,离心,取血清1ml,按血样预处理操作,测得DZ和M₁的峰高。

1.3.3数据处理4名受试者的药时曲线用PKBP-N1程序在386微机上进行拟合,得到DZ和M₁的药物动力学参数。

2结果

2.1色谱行为和标准曲线用不同浓度的DZ和M₁对峰高比进行线性回归,得血清标准曲线方程分别为:

DZ:Y=0.02194C-0.01303,r=0.9996(5.45～272.5ng·ml^-1)

M₁:Y=0.02492C-0.00753,r=0.9998(5.85～292.5ng·ml^-1)

DZ的最低检测浓度为2.87ng·ml^-1,M₁的最低检测浓度为1.99ng·ml^-1。层析结果为单一色谱峰,出峰保留时间为:DZ 10.3min,M₁ 8.4min和内标(盐酸普罗帕酮)12.9min。色谱图见图1。

图 1色谱图

A 标准品中地尔硫及去乙酰地尔硫色谱图;B 空白血清中内标的色谱图;C 样品血清中地尔硫去乙酰地尔硫及内标色谱图;1 地尔硫;2 去乙酰地尔硫;3 内标(盐酸普罗帕酮)

2.2回收率用4种不同的DZ和M₁血清标准品进行回收试验,其结果见表1。

表 1地尔硫

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