摘要：三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸(P3C)是一种B细胞分裂原，并能在体内激活细胞毒T淋巴细胞.它是一种无毒佐剂.对该佐剂进行了合成，重点进行了化合物Fmoc-Lys P3C的合成方法研究.所合成化合物的纯度和产率均较高，具有制备意义.

Synthesis of Tripalmitoyl-S-glyceryl

Cysteine (P3C) and Its Intermediate Fmoc-Lys P3C

Wu Guizhi

（309 Hospital of PLA,Beijing 100091）

Lu Weiai

（Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850)

Chen Zhengying

（Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850)

Pan Heping

（Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850)

Abstract：The adjuvant tripalmitoyl-S-glyceryl cysteine(P3C)derived from a lipoprotein of Escherichia coli has been found as a potential adjuvant for vaccines.As a built-in adjuvant in the Multiple Antigen Peptide System approach P3C is suitable.And P3C was corporated to the side chain of a carboxyl terminal lysine as Fmoc-Lys P3C.These two compounds were synthesized in our article.P3C was obtained from N,N′-dipalmitoyl-cystine di-tert-butyl ester via reduction to the thiol,and S-alkylation with racemic 3-bromo-1,2-propanediol followed by esterification with palmitic acid in the presence of dicyclohexylcarbodiimide/dimethylaminopyridine and deprotection with trifluoroacetic acid.Fmoc-Lys P3C was prepared via three steps with Fmoc-Lys(Boc)as the starting material.Fmoc-Lys(Boc)reacted with the bromoacetophenone to give the Fmoc-Lys(Boc)-OPac.After removal of the Boc protecting group,P3C was coupled to the ε-amino group of lysine via the HBTU/HOBt method to give the Fmoc-Lys(P3C)-OPac.Removal of the phenacyl ester with zinc in 90% acetic acid gave Fmoc-Lys P3C.The compounds were characterized by elemental analyses and mass spectra.The results showed that the synthetic method was feasible and the yields and quality of the products were good.

Key words：tripalmitoyl-S-glyceryl cysteine(P3C);Fmoc-Lys P3C;organic synthesis▲

三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸(P3C)^〔1〕是来自大肠杆菌的脂蛋白，是一种无毒的佐剂.P3C具有三条疏水性的烷基链，还可在脂骨架中作为亲脂膜的锚定部分插入脂质体中，使疫苗在体内得到缓释^〔2〕.P3C非常适于作多重抗原肽体系(MAPS)的嵌入佐剂，来增强抗原肽的免疫原性，延长作用时间.将P3C作为佐剂嵌入到MAPS肽抗原中的方法是：通过P3C分子中的半胱氨酸游离羧基与Fmoc-Lys-OH的ε氨基形成肽键，由此得到的Fmoc-Lys P3C作为一种保护氨基酸单体，在合成MAPS的低聚赖氨酸核心肽时接入序列中.

1合成路线设计

P3C及Fmoc-Lys P3C的合成文献^〔3，4〕均有的报道，本实验在此基础上对其合成方法和条件进行考察，并进行了一定程度的改进.P3C的合成参照文献〔3〕方法合成.

在进行Fmoc-Lys P3C的合成中发现文献^〔4〕合成方法存在一些不足之处.文献〔4〕中对Fmoc-Lys(Boc)-OPac的合成是先将Fmoc-Lys(Boc)制成相应的铯盐再与α-溴代苯乙酮反应，其间需经甲苯带水及用油泵蒸除DMF等操作，经HCl-HOAc脱除其Boc侧链保护基，再以DCC法与P3C缩合得到Fmoc-Lys(P3C)-OPac，最后用90%的乙酸脱除Pac基团得到Fmoc-Lys P3C.实验操作麻烦、耗时，DCC缩合效果较差，且每步反应均需用硅胶色谱纯化产品，产率较低.对此合成方法进行了改进，改用Fmoc-Lys(Boc)的二异丙基乙胺盐与α-溴代苯乙酮在乙酸乙酯中反应合成相应的Pac酯，不但操作简便且粗产品纯度较高，重结晶后TLC检测为一个斑点；在中间体Fmoc-Lys(P3C)-OPac的合成中，以50%的TFA-CH₂Cl₂溶液脱除Boc保护基，以HBTU-HOBt-DIPEA作缩合剂，反应速度快，缩合效率高，重结晶后纯度高；在合成Fmoc-Lys P3C的反应中，以甲醇固化粗产物能满意地分离杂质，不必使用硅胶色谱柱纯化产品.改进后的方法简化了操作，提高了产率，具有制备意义.其合成路线见图1.

Fig.1The synthetic route of Fmoc-Lys P3C

2实验部分

2.1P3C的合成

2.1.1L-胱氨酸二叔丁酯(Ⅰ)的合成

取15 g(62.4 mmol)半胱氨酸溶于45 g(271 mmol)60%的高氯酸溶液中，加入350 mL(2.62 mol)醋酸叔丁酯，于室温反应60 h.用2 mol/L氢氧化钠水溶液和1 mol/L碳酸氢钠水溶液调pH为7.8，乙醚萃取，饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥.减压浓缩，得14.0 g无色油状物，收率：63%(文献^〔3〕收率：67%).产品勿需纯化，可直接用于下步反应.

2.1.2N,N′-二棕榈酰-胱氨酸二叔丁酯(Ⅱ)的合成

取17.6 g(64 mmol)棕榈酰氯和14.3 mL(130 mmol)N-甲基吗啉溶于100 mL无水二氯甲烷中，将此溶液在搅拌下加入到10.9 g(31.0 mmol)化合物(Ⅰ)溶于50 mL二氯甲烷的溶液中，室温反应3 h.加入3 mL水，减压蒸干，用150 mL二氯甲烷溶解残留物，依次用5%的柠檬酸溶液、水、5%的碳酸氢钠和水洗涤，无水硫酸钠干燥.减压蒸干，甲醇(0℃)重结晶，先后用冷甲醇和冷石油醚(bp 30～60℃)洗，五氧化二磷和固体石蜡干燥，得白色固体18.8 g，收率：73%，mp 76℃(文献^〔3〕收率：77%，mp 76℃).

2.1.3N-棕榈酰-半胱氨酸叔丁酯(Ⅲ)的合成

取1.26 g(1.52 mmol)化合物(Ⅱ)溶于20 mL氯仿中，加入0.48 g(4.78 mmol)三乙胺和1.0 g(6.48 mmol)二硫苏糖醇(DTT)，在氮气存在下室温搅拌2 h.依次用氮气饱和的5%的柠檬酸溶液和水洗，无水硫酸钠干燥.减压浓缩，甲醇于-20℃下重结晶，五氧化二磷干燥，得白色固体700 mg，收率：55%，mp 46～48℃(文献^〔3〕收率：66%，mp 46～48℃).

2.1.4S-〔2，3-二羟基-(2RS)-丙基〕-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸叔丁酯(Ⅳ)的合成

取1.5 g(3.61 mmol)化合物(Ⅲ)溶于30 mL DMF中，加入3.7 mL(36.1 mmol,5.6 g)3-溴-1，2-丙二醇和5 mL(3.61 mmol，3.65 g)三乙胺，80℃搅拌15 min，室温搅拌1 h.减压蒸干，加入100 mL氯仿溶解残留物，并用氮气饱和.依次用氮气饱和的5%的柠檬酸水溶液和水洗，无水硫酸钠干燥.减压浓缩，氯仿-石油醚(bp 30～60℃)于-20℃下重结晶.得白色固体1.44 g，收率：82%，mp 44～45℃(文献^〔3〕收率：74%，mp 43℃).

2.1.5S-〔2，3-双棕榈酰氧代-(2RS)-丙基〕-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸叔丁酯(Ⅴ)的合成

取1.3 g(2.65 mmol)化合物(Ⅳ)溶于25 mL氯仿中，在此溶液中加入1.6 g(6.24 mmol)棕榈酸、80 mg(0.65 mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)和1.3 g(6.3 mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，室温反应2 h.加入50 mL氯仿，滤除沉淀，依次用5%柠檬酸水溶液、水、5%的碳酸氢钠水溶液和水洗，无水硫酸钠干燥.减压蒸干，氯仿-甲醇重结晶，得白色固体2.25 g，收率：88.5%，mp 60℃(文献^〔3〕收率：59%，mp 60℃).

2.1.6S-〔2，3-双棕榈酰氧代-(2RS)-丙基〕-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸(Ⅵ)的合成

取440 mg(0.48 mmol)化合物(Ⅴ)溶于5 mL(65.3 mmol,7.45 g)三氟乙酸(TFA)中，在封闭管瓶中室温搅拌2 h.在50℃水浴中减压蒸干，加入10 mL水，即析出白色沉淀，用冰水洗，氯仿-石油醚(bp 30～60℃)于-20℃重结晶，得330 mg，收率：75.2%，mp 63℃.元素分析C₅₄H₁₀₄O₇NS，计算值(%)：C 71.21，N 1.54，H 11.43；实测值(%)：C 70.96，N 1.71，H 11.70.MS(FAB)m/z：910，932.7(M+Na)〔文献^〔3〕收率：82%，mp 63℃，MS(FAB)m/z：911(M+1)〕.

2.2Fmoc-Lys P3C的合成

2.2.1Fmoc-Lys(Boc)-OPac(Ⅶ)的合成

取1.0 g(2.14 mmol)Fmoc-Lys(Boc)溶于8 mL乙酸乙酯，加入424 mg(2.14 mmol)α-溴代苯乙酮和276 mg(2.14 mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温搅拌过夜.析出白色沉淀，加少量水使沉淀溶解，分出水层弃去，补加50 mL乙酸乙酯，依次用水、0.5 mol/L碳酸氢钾水溶液和水洗涤，无水硫酸镁干燥.减压蒸干，异丙醇-石油醚(bp 30～60℃)重结晶，得白色固体986.7 mg，收率：78.6%，mp 102～103℃.TLC：Rf=0.2(正己烷-乙酸乙酯=7∶3).MS(FAB)m/z：586，587(M+1)〔文献^〔4〕收率：55%，MS(FAB)m/z：587(M+1)〕.