摘要建立了高胆固醇血症（Hypercholesterolemia，HC）的动物模型，旨在研究HC机体生理机能的改变以及外源性抗氧化剂对细胞的保护作用。NEW兔分别给予正常饮食,高胆固醇饮食,高胆固醇饮食加卡维地洛或普萘洛尔。8周后动物处死,取出胸主动脉，分别进行以下试验:① 动脉组织中谷胱甘肽（GSH）定量; ② 主动脉环对外源性ONOO^-的反应;③主动脉组织匀浆ONOO^-中NO的再生；④ONOO^-引起的动脉组织损害。结果表明：①HC减少了血管组织中GSH的量(0.52±0.08μmol^．g^-1 vs 对照组的0.86±0.04 μmol^．g^-1, P＜0.01)；②减少了血管对ONOO^-的舒张反应(40%±4.1% vs 对照组的76%±3.2%,P＜0.01)；③由ONOO^-中NO的再生减少(387±40 pmol^．L^-1 vs 对照组的662±51 pmol^．L^-1, P＜0.01),④加重ONOO^-对血管组织的损害，表现为LDH的释放量增加（37%±4.4% vs 对照组的14%±2.6%,P＜0.01)；⑤具有自由基清除作用的β-受体阻滞剂卡维地洛处理的HC动物呈显著的保护作用，血管组织GSH的量增加（0.79±0.05 μmol^．g^-1， P＜0.01 vs 非处理的HC组)；血管对ONOO^-反应增强（61%±2%, P＜0.01) ; 由ONOO^-中NO的再生增加(583±39 pmol^．L^-1, P＜0.01);减少ONOO^-引起的组织损害，LDH释放减少(19.0%±1.8%,P＜0.01)。这些结果表明HC损害了GSH调节的抗ONOO^-毒性的机制,致使血管组织易遭受氧化损伤。

Hypercholesterolemia Impairs a Detoxification Mechanism Against Peroxynitrite

and Renders the Vascular Tissue More Susceptible to Oxidative Injury

Liu Gaolin

（Dept. of Clinical Pharmacology, Changzheng Hospital,

Second Military Medical University, Shanghai 200003, P.R.China）

An Dengkui, Zhang Zhengxing

（China Pharmaceutical University）

ABSTRACTObjective: To evaluat the hypercholesterolemia and determine the effects of carvedilol, a β-blacker with free radical-scavenging activity, on these hypercholesterol-induced changs in rabbits model. Methods: New Zealand white rabbits were fed either a normal diet, a high-cholesterol diet, or a high-cholesterol diet supplemented with either carvedilol or propranolol. Eight weeks later, the rabbits were killed, and the thoracic aortas were isolated. Total glutathione(GSH) content of aortic tissue, vasorelaxation response of aortic rings to exogenous ONOO^-, NO regeneration resulting from ONOO^- in aortic homogenate, and ONOO^--induced aortic tissue injury were examined. Results: The results showed that hypercholesterolemia decreased tissue GSH content (0.52±0.08 vs 0.86±0.04 μmol/g in control, P＜0.01), attenuated the vasorelaxation response to ONOO^- (40±4.1% vs 76±3.2%, P＜0.01), reduced NO regeneration from ONOO^- (387±40 vs 662±51 pmol/L, P＜0.01), and potentiated ONOO^- induced vascular tissue injury (37±4.4% vs 14±2.6% of increased in lactate dehydrogenase release after 3-morpholinosydnonimine exposure, P＜0.01). Treatment of the hypercholesterolemic rabbits with carvedilol, but not propranolol, significantly preserved tissue GSH content (0.79±0.05 μmol/g vs nontreated hypercholesterolemic rabbits), restored the vasorelaxation to ONOO^- (61±2%, P＜0.01), increased NO regeneration from ONOO^- (583±39 pmol/L, P＜0.01), and attenuated tissue injury (19±1.8%, P＜0.01). Conclusion: These results suggested that hypertholesterolemia impairs the GSH-mediated detoxification action against ONOO^- and result in the mechanism of vascular tissue more susceptible to oxidative injuury.

KEY WORDSFree radical; Hypercholesterolemia; Glutathione; Tissue injury▲

NO和·O^-₂（superoxide）反应形成的ONOO^-是一种强氧化剂。ONOO^- 在很多人类疾病中,能够引起细胞死亡和组织损伤,包括动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、休克和缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤。最近的研究揭示,在生理条件下,有一种有效对抗ONOO^-毒性的自身防御系统。Liu等^［1］首先报道ONOO^-可引起NO样扩血管作用。Wu^［2］和Noro等^［3］的研究表明，ONOO^-与GSH反应形成一种S-nitrosothiol化合物并且在较长时间里重新产生低浓度的NO。而NO刺激可溶性SG并导致血管扩张和抑制血小板聚集。与ONOO^-的细胞毒作用不同的是, nmol^。L^-1水平的NO在很多的研究中已证实病理条件下可发挥显著的细胞保护作用^［4，5］。因此,ONOO^-与GSH反应再生NO已被认为作为一种对抗ONOO^-毒性作用的主要机制。然而,在病理条件下如高胆固醇血症（Hypercholesterolemia, HC）,GSH量的变化和抗ONOO^-的解毒机制还没有阐明。

卡维地洛是一种新型的扩血管及β-受体阻断药,临床上已试用于轻、中度高血压和充血性心力衰竭的治疗。它是一种强效的抗氧化剂，对自由基诱导的细胞损伤有明显的保护作用并可减弱I/R时引起的心肌损害。然而，在HC时用卡维地洛治疗能否建立以GSH为中心的抗氧化系统与ONOO^-毒性之间的平衡，由此而减少ONOO^-引起的组织损害尚未见报道。

本研究的目的：① 探测以GSH为中心的自身防御系统的状态；② 阐明以GSH为中心的自身防御系统对抗ONOO^-诱导组织损害的机制；③在HC模型中研究具有抗氧化作用的卡维地洛对已发生变化的抗氧化解毒系统的作用机理。

1材料和方法

1.1材料

卡维地洛由美国SmithKline Beecham Pharmaceuticals惠赠。含1%胆固醇食品购自Zeigler Bros公司。其他试验中所用的药品或材料除了专门注明的外,均购自sigma公司。

1．2动物和喂食方案健康成年雄性NZW兔2.1～2.7 kg,由中心眼动脉取血测定基础血浆脂质(胆固醇和甘油三酯)。受试前动物随机分成4组,每组14～16只。① 正常饮食组；② 1%胆固醇饮食组；③含有1%胆固醇及Carvedilol(1200 ppm)组；④含有1%胆固醇及Propranolol(1200 ppm)组。

1．3化学合成ONOO^-参照Liu和Beckman等报道的方法制备ONOO^-［1］。制备的ONOO^-装于一具塞的15 ml离心管内,-20℃ 贮存， 1周内使用。

1．4主动脉组织中GSH测定实验动物由胸骨中线切口行开胸术，快速取出胸主动脉并置于冰浴的5% SAA（sulfosalicylic acid）溶液中。用5％ SSA洗涤血管3～4次，以保证无血凝块粘附,并且除去血管上的脂肪和粘连组织。取主动脉组织(约50 mg)放置于5% SSA (1∶100， w/v)中匀浆。匀浆液在4 ℃,6000 g离心10 min,不含蛋白的上清液-70 ℃ 存贮，1周内采用Tietze^［6］报道并经Vandeputte^［7］修改的酶循环法测定主动脉组织中GSH的含量(μmol·g^-1组织)。

1．5离体动脉环(ring)研究清除掉脂肪和粘连的离体主动脉割成4～5 mm长的小环，挂在不锈钢钩上。然后悬吊血管环于容积为7.5 ml的组织浴池中,并连接在WindoGraf记录仪FORT-10张力转感器上。待平衡后, 浴池中加入TxA₂的类似物U-46619 (Biomol Res. Lab.)，终浓度为100 nmol·L^-1，以达到最大的血管收缩。经多次反复测试获得环对ONOO^-或分解的ONOO^-(107～104 mol·L)的累积曲线。待反应稳定后， 用K-H缓冲液洗涤浴池若干次,并允许张力回到基线， 以便再一次试验。同样的程序,然后给予酸化的NaNO₂(NO donor)(10^-7～10^-4 mol·L^-1)。

1．6NO分析对Wu等^［2］报道的方法进行了改良,利用化学发光法在NO化学发光分析仪测定NO浓度。由ONOO^-中再生NO的量通过标准曲线而得到。

1．7ONOO^-引起组织氧化损伤使用Keaney等^［8］报道的方法对ONOO^-所致离体主动脉氧化损伤进行研究。主动脉经1 mmol·L^-1的SIN-1或Vehicle(PBS溶液,pH 5.0)过2 h孵化后,使用动力学平盘读数器分析定量K-H溶液中的LDH。LDH的值通过由LDH酶溶液以倍比梯度稀释制得的标准曲线中求得。比较来自同只动物的动脉组织分别经SIN-1和Vehicle处理而得受损的程度。

1．8统计学分析正文及