摘要应用自制的磺胺二甲嘧啶(SM₂)-蛋白质偶联物， 经免疫得高质量兔抗SM₂抗血清。 建立了测定SM₂的酶联免疫吸附分析(ELISA)竞争法， 重现性好， 特异性强， 测定线性范围0.05～5.0 μg.L^-1， 最低检出浓度为0.025 μg.L^-1。 全脂牛奶与脱脂牛奶的加标实验回收率分别为82.1%～128.8%和90.6%～124.0%。 测定了270个牛奶试样， 未发现大于欧盟允许的最高浓度25 μg^.L^-1的阳性试样。

Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Sulphadimidine Residues in Milk

Yang Hong

School of Pharmacy

Deng Anping

School of Public Health, West China University of

Medical Sciences, Chengdu 610041, P.R.China

ABSTRACTHigh qualitative anti-SM₂ serum of rabbit was obtained through immunozation with self-produced sulphadimidine(SM₂)-protein conjugates. The direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for SM₂ was established, reproducibility being good, specificity potent. The linear range determined was 0.05—5.0 μg.L^-1, lowest detection limit was 0.025 μg*L^-1. Added standard experimental recoveries of wholl milk and skimmed milk were from 82.1 to 128.8% and from 90.6 to 124.8?%, respectively. The positive sample of peak concentration up to 25 μg.L^-1 more than the upper limit allowed EU had been not found.

KEY WORDSSulphadimidine; Enzyme-linked immunosorbent assay; Sulphonamide; Milk

磺胺二甲嘧啶(SM₂)是应用广泛的抗菌药， 也用作饲料添加剂， 以提高奶牛、 生猪的抗病能力和增进其食欲， 提高产奶量和产肉量。 然而， SM₂在牛奶或猪肉中的残留量超过一定值将有害消费者健康， 如可能引起甲状腺癌^［1］。 欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物设立了最高允许值， 即单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μg^.kg^-1， 磺胺类药物总量不得超过100 μg^.kg^-1［2］， 我国目前尚无具体规定。

测定SM₂的常用方法中， 仪器分析法(如HPLC、 GC、 TLC等)较准确， 但试样的预处理及测定操作繁琐， 费用高， 微生物法简便， 但灵敏度和特异性低^［3］。

以抗原、 抗体免疫反应为基础的免疫分析法应用日益广泛， 其中简便、 快速、 灵敏的酶联免疫吸附分析(ELISA)应用最广。 ELISA测定SM₂的报道已包括牛奶等试样^{［2，4～6］}。 用本文建立的方法仅需用缓冲溶液稀释试样便可直接测定， 分析时间约2 h， 重现性、 特异性和回收率等指标均较满意， 与同类文献^［2，4］相比， 灵敏度要高1～2个数量级。

1实验部分

1.1试剂与仪器

SM₂、 辣根过氧化物酶(HRP)、 N-羟基琥珀酸亚胺、 N，N-二环乙基碳二亚胺为Sigma产品， 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、 牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OV)为Serva产品， 用于酶标记物制备的SM₂-羧基化衍生物为捷克Dr.Biosfor馈赠， 其余试剂为分析纯。 使用的主要仪器有酶标测定仪(芬兰， Labsystem)、 酶标板自动洗涤仪(奥地利， 812SW1)、 96孔酶标板(丹麦， Nunc)。

1.2实验方法

1.2.1免疫抗原的制备

免疫抗原为SM₂-蛋白质偶联物， 用重氮盐法制备。 将57 mg(0.2 mol*L^-1)SM₂溶于4 ml 0.5 mol^.L^-1 H₂SO₄， 置0～4℃冰浴， 搅拌下逐滴加入1 ml 1 mol^.L^-1 NaNO₂。 将BSA和OV各100 mg分别溶于4 ml pH?9.4混合硼酸盐-碳酸盐缓冲溶液中， 搅拌下逐滴加入生成的重氮盐溶液4 ml和1 ml， 用1 mol^.L^-1 NaOH调pH至8～10， 室温反应1 h， 反应液透析过夜， 过Sephadex G-25柱， 得纯化的SM₂-蛋白质偶联物， 冻干存放。

1.2.2HRP标记物的制备用改进的活化酯法将SM₂-羧酸衍生物与HRP共价交联^［7］， 过Sephadex G-25柱除盐， 用0.01 mol*L^-1 NaHCO₃作洗脱液， 收集第一峰， 加等体积甘油， 存放于-20℃。

1.2.3抗血清和标准液的制备用制备的免疫抗原经常规免疫方法对8只新西兰属种兔进行免疫， 制得兔抗SM₂抗血清， 检查其免疫反应， 筛选出稀释度最高的高质量抗血清。

将SM₂标准品用甲醇配成100 mg^.L^-1， 用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释成1 000 μg^.L^-1的储备液， 将储备液用PBS(或1∶100稀释的全脂牛奶或脱脂牛奶)制成0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0 μg^.L^-1的标准溶液。

1.2.4ELISA操作步骤用包被液(pH?9.6的0.05 mol^.L^-1碳酸盐缓冲溶液)稀释抗血清， 每孔200 μl包被酶标板， 室温过夜， 用含Tween20的PBS洗涤3次后， 每孔加入100 μl标准液(或100 μl用PBS稀释至1∶100的牛奶试样)和100 μl用PBS稀释的酶标记物， 水平振荡1 min， 室温温育1 h。 酶标板洗涤3次， 加入200 μl显色液(10 g^.L^-1)TMB100 μl， 60 g^.L^-1H₂O₂10 μl， 加pH5.5的2.0 mol^.L^-1乙酸-柠檬酸混合缓冲溶液500 μl和重蒸水10 ml混合制得)， 水平振荡15 min显色， 加100 μl?2 mol^.L^-1?H₂SO₄终止显色， 于酶标测定仪上读取吸光度A_450nm。

1.2.5加标实验及牛奶试样的采集和分析采集14个不含SM₂的全脂牛奶试样， 用于加标实验， 其中7个离心(3 000 r.min^-1，15 min)脱脂成脱脂牛奶， 另7个仍为全脂牛奶。 于990、 995、 975 μl全脂牛奶或脱脂牛奶中分别加入浓度为1 000 μg*L^-1的SM₂标准液10 μl和浓度为10 000 μg^.L^-1的SM₂标准液5 μl和25 μl， 制成加标浓度分别为10、 50、 250 μg^.L^-1的试样。 混匀后室温放置至少1 h。 加标试样用PBS稀释成1∶100稀释液， 按1.2.4节进行ELISA分析。 加标试样的测定值由同一酶标板得到的标准曲线求得， 计算加标回收率。

在两个月时间内， 先后采集市售牛奶试样270个， 每份约20 ml， 盛于封口塑料瓶中， -20℃存放。 1周内用ELISA测定， 于室温自然解冻， 混匀后取50 μl， 用PBS稀释至1∶100， 每个试样平行测定4孔。

2结果与讨论

2.1抗血清的稀释度和特异性

制得的兔抗SM₂抗血清稀释度均在1∶2 000～1∶10 000之间， 选用稀释度为1∶10 000的(记为SM₂-OV-C)用于实验。 SM₂-OV-C与16种磺胺类药物的交叉反应结果为： 与磺胺甲氧嘧啶(其结构与SM₂仅差一个-CH₃)的交叉反应率仅为5.2%， 其余15个磺胺类药物交叉反应率均不大于1.0%(最大的3个为磺胺氯吡嗪1.0%， 磺胺嘧啶0.7%， 磺胺间二甲氧嘧啶0.6%， 其余12个均低于0.5%)， 而与其它8种抗生素(包括羟氨苄青霉素、 庆大霉素等)的交叉反应率均小于0.1%。 表明所用的抗血清特异性强。

2.2ELISA的实验条件和分析特性

用方阵滴定法优选ELISA的实验条件， 抗血清用包被液稀释至1∶10 000， 酶标板每孔200 μl， 室温包被过夜。 HRP酶标标记物用PBST稀释至1∶200 000， 每孔加100 μl。

图1为SM₂在PBS和PBS稀释至1∶100的全脂牛奶和脱脂牛奶中的ELISA标准曲线。 可见3条曲线靠近， 表明全脂牛奶或脱脂牛奶经1∶100稀释后基本上不存在基质效应的影响。 故牛奶试样中的SM₂浓度可以直接从PBS的标准曲线读出。

1SM₂在PBS、 全脂牛奶、 脱脂牛奶中的标准曲线

灵敏度可由竞争抑制曲线(未绘出)中50%抑制率所对应的浓度求出， 本法灵敏度约为0.2 μg.L^-1。 最低检出浓度可由标准曲线中零浓度点吸光度标准差的3倍求得对应的浓度， 本文由图1可求得最低检出浓度约为0.025 μg.L^-1， 比同类文献^［2，4］低1～2个数量级， 也远低于欧盟最高<