摘要凋亡和坏死是细胞死亡的两种主要方式，近期凋亡在脑缺血性细胞死亡中的作用逐步受到重视，这对近年来脑缺血中细胞凋亡的研究必有助益。

中国图书分类号R 329.25； R 329.26； R 743.31

文献标识码A文章编号1001-1978(1999)04-0307-04

Apoptosis in cerebral ischemia

LIU Xuan, ZHU Xing-Zu

(Department of Pharmacology, Shanghai Institute of Materia Medica,

Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)

ABSTRACTApoptosis and necrosis are two main kinds of cell death. Inrecent years, apoptosis in cerebral ischemic cell death has gained more and more attention. Briefly summarized the recent of research on ap optosis in ce rebral ischemia.

KEY WORDSischemia; neuronal cells; apoptosis

早在1972年，Kerr JFR等就提出根据细胞的超微结构特征可以把细胞死亡的方式分为凋亡和坏死两种方式。但是，早期研究者认为神经元的凋亡方式只存在于生长发育中神经元的正常死亡或一些慢性脑损伤的发展过程中，不存在于急性、严重的脑损伤如脑缺血所致神经元死亡中。直到近10年，凋亡在脑缺血性细胞死亡中的作用才逐步受到重视^［1,2］。然而，由于对凋亡和坏死的判断标准目前仍有争议，不同的报道有时有互相矛盾的结果。因此，本文将从形态学特征、生化特征及基因调控特征3个方面分析总结凋亡在脑缺血性神经元死亡中的作用和地位。在每个方面的分析中，我们既引用了用各种脑缺血动物模型获得的在体研究结果，也引用了用原代培养神经元缺氧或兴奋性毒性损伤模型获得的离体研究结果。

1形态学特征

细胞凋亡过程的形态学变化可以分为3个时期。以8d大鼠纹状体部分神经元在发育过程中凋亡的形态学变化为例，凋亡初期，细胞核内染色体凝缩并沿核膜形成月牙形团块，细胞质开始浓缩但各种细胞器如线粒体、内质网等均正常。中期，染色体进一步固缩成形态规则的数个紧密小球，细胞核裂解为碎片，每个碎片由基本完整的核膜包裹着染色体小球组成。细胞质浓缩，内质网解体，线粒体略有肿胀，细胞膜皱缩。末期，细胞通过“出芽”离散为数个“凋亡小体”，每个小体中含有部分细胞质，残存细胞器和一定量的核碎片，并由细胞质膜紧紧包裹。这些小体很快被别的细胞吞噬，因此细胞内容物绝不会漏出到细胞间隙中。相反，细胞坏死时，早期染色质呈絮状，无再分布现象，晚期染色质消失。坏死过程中细胞胞浆逐渐肿胀，细胞器表现为进行性降解。坏死末期细胞膜破裂，内容物释放到细胞间隙并引发炎症反应^［3］。

形态学特征是最早被用来区分凋亡和坏死的标准，目前仍是最被广泛承认的标准。在不同的实验性脑缺血模型所致损伤过程中，均有报道观察到有凋亡特征的神经元。Nitarori T等发现沙土鼠全脑缺血后其海马CA₁区神经元的染色体固缩，且细胞有皱缩现象^［4］。脑缺血大鼠的多巴胺神经元也表现出明显的凋亡特征^［5］。在新生小猪缺氧性脑缺血48h后，光镜和电镜观察均发现扣带回区有凋亡特征的神经元数量增多^［5］。此外，对27个人类脑卒中患者标本的分析表明，人类卒中后神经元死亡的过程和方式与大鼠双侧颈总动脉结扎合并低血压所致海马神经元损伤的特点很相似。人类卒中亚急性期和大鼠缺血48至72 h期间的神经元均有凋亡的特征，而人类卒中急性和慢性期时的神经元无此特征^［7］。

体外研究发现，缺氧可使培养的皮层神经元的细胞体积缩小，胞核紧密固缩^［8］。对于兴奋性毒性损伤，神经元在给予低剂量的兴奋性氨基酸时主要以凋亡方式死亡，而在给予高剂量时主要以坏死方式死亡。并且，神经元在兴奋性损伤急性期主要以坏死方式死亡而随后则有部分细胞以凋亡方式死亡^［9］。

虽然上述报道表明脑缺血后死亡的神经元可出现凋亡的特征，但也有不少报道（尤其是在体研究报道）观察不到脑缺血后有凋亡特征神经元的存在。这可能与研究时选用的观察时间，观察脑区以及所用缺血模型不同有关。因此，要从形态学方面确认脑缺血中凋亡的存在与否，必须进行严格的、系统的、有说服力的细胞超微结构形态学研究。

2生化特征

凋亡细胞最典型的生化特征就是其DNA的裂解方式。凋亡中，细胞染色质的核小体间DNA 片段性断裂，形成由50～300碱基对组成的DNA碎片，用琼脂糖电泳检测时表现为特征性的梯形条带（ladder）。而坏死发生时，由于核DNA是被随机切割且组蛋白也同时降解，故形成扩散的涂抹性条带。此外，凋亡细胞的DNA缺口可用原位DNA末端标记法如末端脱氧转核苷酸酶介导的dUTP-生物素标记法（TUNEL）检测。一般认为凋亡细胞呈TUNEL阳性，而坏死细胞呈 TUNEL阴性。

大量的报道证实脑缺血后脑中发现有TUNEL阳性细胞或组织中提取的DNA电泳后呈梯形条带。沙土鼠和大鼠脑缺血后脑组织的DNA都表现出梯形电泳条带^［3］。全脑缺血后，在沙土鼠的海马CA₁区^［10］和大鼠海马区^［11］、纹状体区^［12］均可以观察到有神经元的DNA发生片段性碎裂。局部缺血大鼠中也可见相似结果^［13］。Saviano G等则用TUNEL和DNA电泳法同时确定了脑缺血后小鼠脑组织中凋亡神经元的存在^［14］。而且，脑缺血后再灌与否和缺血损伤的程度均影响DNA片段性碎裂细胞的分布情况^［15］。

体外研究也发现，缺氧^［16］或给予兴奋性氨基酸^［17］可使细胞DNA的电泳条带呈梯形特征，或可观察，但细胞核DNA的断裂方式是核小体间连接的断裂，即有典型的凋亡特征。本实验室的研究结果也表明，给予原代培养的皮层神经元200～500μmol·L^-1 的谷氨酸可以使细胞中提出的DNA在电泳时呈典型的梯形条带。

截止目前为止，关于生化特征方面的报道已有很多且结果也较为一致。但是，有研究者认为是否有DNA片段性碎裂特征并不能作为区分凋亡和坏死的标准。他们的依据是某些具有明显坏死形态学特征的细胞也可表现为DNA片段性碎裂，尤其是可呈TUNEL阳性^{［3，17，18］}。

3基因调控特征

由于凋亡是一个严格控制的、有序的死亡过程，因此凋亡过程中必需有一系列基因的参与和调控。相反，坏死是一个被动的死亡过程，细胞是因为在受到严重损伤时无法维持自身结构和功能的完整而崩溃死亡的。参与凋亡过程的基因调控机制目前仍未完全清楚。已知的基因主要有凋亡诱导基因如p53,c-myc等和凋亡抑制基因如bcl-2等。在凋亡诱因的刺激下，凋亡调控基因的转录和翻译水平均发生变化，进而影响其它基因如白细胞介素1－β转化酶（ICE）家族基因的表达。ICE家族基因编码的蛋白酶属于Caspases,可激活特定的核酸内切酶。核酸内切酶进入细胞核内对DNA进行片段性切割。因此，在细胞死亡过程中是否有这些基因的参与，以及阻断这种凋亡特有的调控系统是否能影响细胞的死亡状况，可以作为区分凋亡与坏死的标准。

由于凋亡的调控过程中必需有新的蛋白质和mRNA的合成，早期人们试图用蛋白合成抑制剂如放线菌酮或RNA合成抑制剂如放线菌素D来考察脑缺血中凋亡的存在与否。遗憾的是，可能是由于这些抑制剂的作用特异性不强，这方面的报道中互相矛盾的结果很多，无法得出令人信服的结论^［3，17］。

凋亡调控基因被报道广泛参与了脑缺血后的神经元损伤。大鼠全脑缺血后，其Bcl-X基因的mRNA和蛋白水平均升高^［19］。Bax的mRNA水平在脑缺血后的缺血性敏感神经元和非敏感神经元中都有上升^［3］。p53的靶蛋白产物p21 WAF1/CIP1的水平^{［20 ］}和Bax的蛋白水平^［21］也有报道能被脑缺血损伤诱导升高。而且，在脑缺血后神经元死亡过程中有ICE类蛋白酶的参与^{［22，23］}。给大鼠脑内注射ICE类酶的抑制剂可以减轻脑缺血所致神经元损伤^［24］。

在培养小脑颗粒神经元时，给予兴奋性氨基酸可以诱导神经元中p53的表达^［27］和ICE类酶的激活^［28］。缺氧则可使培养皮层神经元中bcl-2的水平下调，激活I CE类酶^［29］，也可诱导p53的表达^［30］。ICE类酶的抑制能保护神经元对抗缺氧缺糖所致损伤^［31］。我们在实验中用流式细胞术和免疫细胞化学法等方法分析时也发现，兴奋性氨基酸（谷氨酸）可使培养皮层神经元中的bcl-2的水平下调、Bax的水平上调。并且，给予谷氨酸12 h后神经元中Caspase-3的活性显著升高。

转基因研究的结果给我们提供了更有力的证据。过度表达凋亡抑制基因bcl-2或通过病毒载体将bcl-2基因转入动物的大脑皮层，或敲除凋亡促进基因Bax均可以减轻脑缺血后神经元的损伤程度。相反，凋亡诱导基因p53敲除的小鼠对局部脑缺血损伤的敏感度下降^［17］。凋亡抑制基因Bcl-XL过度表达的小鼠也能部分对抗脑缺血性损伤^［26］。因此，我们可以认为这些凋亡的调控机制在脑缺血性细胞死亡中发挥了一定<