［摘要］目的：研究新的牛血红蛋白（Hb）的聚合剂，制备能 满足 血液替代品需要的聚合牛Hb（polyHb）。方法：用聚合反应动力学和 热力学原理寻找新的聚合剂，用电泳和HPLC等技术比较新聚合剂2-羟基丙醛与乙醇醛和戊 二醛的聚合反应和反应产物的特性， 用计算机技术比较和模拟2-羟基丙醛和乙醇醛聚合的 牛Hb的结构。结果：2-羟基丙醛聚合牛Hb的反应温和，反应产物的 分子结构稳定，以低聚态为主并有适合于向组织供氧的氧亲和力，其相对分子质量分布明显 优于乙醇醛的聚合产物，从而有可能从根本上克服产物相对分子质量过高及残留的未反应Hb 所致的血栓形成和血尿等不良反应。结论：2-羟基丙醛是适合于制 备血液替代品的新型Hb聚合剂。

［中图分类号］R977.8［文献标识码］ B

［文章编号］1003-3734(2000)10-0687-05

Researches on new route of preparing blood substitute

WANG He-yaoZHENG Wen-jie

（Pharmaceutical Department,Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital Affiliate d to

Capital University of Medical Science,Beijing 100020,China）

［Abstract］Objective:Search new polymerizing agent of bovine hemogl obin for the use of prepare suitable blood substitute.Methods:Find new polymerizing agent with the theories of kinetics and thermodynamics of polymeri zation reaction,compare the characteristics among polymerizing reactions and pro ducts of 2-hydroxyl propionaldehyde,glycolaldehyde and glutaraldehyde with elec trophoresis and HPLC.Use computer technology to compare and simulate the struct ures between 2-hydroxyl propionaldehyde and glycolaldehyde polymerized products .Results:The reaction of 2-hydroxyl propionaldehyde polymerizing bovi ne Hb was mild,its products were stable and mostly made of lowly polymerized pol yHbs,their oxygen affinity was suitable to supply oxygen to tissues.The distribu tion of the products’ molecular weight was much more better than glycolaldehyde polymerized products，and this supplied the possibility that the adverse effect s induced by ultra-polymerized and unreacted Hbs in the blood substitute made f rom glycolaldehyde polymerized bovine Hb could disappear when blood substitutes manufactured with 2-hydroxyl propionaldehyde were used.Conclusion:2- hydroxyl propionaldehyde is a new agent that is very suitable for the manufactur e of blood substitutes.

［Key words］blood substitute;polymerization ;2-hydroxyl propionald ehyde;glycolaldehyde

多年以来，如何才能恰当地、更好地对血红蛋白(Hb)进行修饰一直是困扰血液替代品 研究者的一个问题，若聚合反应进行得不充分，就意味着原材料的浪费和成本过高；若聚合 程度过高，则 不仅引起Hb结构和功能改变，还可由于这些改变在体内引起复杂的病理生理过程^［1］ 。要将聚合控制在一定程度是非常困难的，因为聚合必然要用双功能或多功能交联剂，这 些交联剂的活性基团随机地与Hb表面的氨基发生亲核加成反应，使聚合持续进行。在目前已 知的交联剂中，最成功的是Baxter公司的双阿司匹林，它可以实现Hb分子内的定位交联。但 这种只有分子内交联的Hb分子虽然不再从肾滤出，但其血浆半衰期只为4h左右，不足以持续 地向机体供氧。增加Hb的相对分子质量可有效延长其循环半衰期，但聚合反应的难以控制使 人们在这一方向的研究进展缓慢。我们探索了一条全新的Hb聚合途径，基本实现了Hb聚合反 应的可控制，目前作者尚未见国外有同类报道。

材料和方法

1材料

试剂：戊二醛(Sigma)，乙醇醛（Sigma），NaBH4（Acros），Sephacryl S-300（Pham acia），丙烯酰胺（Sigma），N,N'-甲叉双丙烯酰胺（SERVA），凝胶过滤高分子量校准试 剂盒（Phamacia），蛋白质低分子量标准（Sigma），2-羟基丙醛（Archros），其余皆为 分析纯。

原料：用板框过滤法提取的牛Hb。

仪器： Insight II 蛋白质工作站（97.0版）（Silicon Graphics），2XZ型旋片真空 泵（浙江临海精工真空设备厂），235/200高压液相色谱议（PERKIN ELMER），TSK－GEL G 4,000SW凝胶过滤柱（TOYO SODA），2197电泳电源（LKB），垂直板电泳仪（北京六一仪 器厂），ABL520血气分析仪 （Radiometer）。

2方法

2.1戊二醛聚合脱氧12%Hb溶液100ml，用1mol/L Na₂CO₃调pH至8. 0，加入2%的戊二醛水溶液4ml，使戊二醛与Hb的分子数比为4:1，于30℃适当搅拌^［2］ 。

2.2乙醇醛聚合将1L 15%的牛Hb（溶于生理盐水，pH6.4）放入3L二口 圆底 烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N₂钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至－0.075MPa后，通入 N₂至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N₂ 4次后，用ABL520血气分析仪监测H b溶液中O₂Hb的浓度降到2%以下。加入脱气的 30ml 1mol/L NaCO₃将Hb溶液的pH值调至8 .5，再加入30ml脱气的10%乙醇醛贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加 入85.7ml的1.56%NaBH₄（溶于10mmol/L NaOH）以终止聚合反应^［3］。反应终止后 保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并调pH至7.4。用5 A血液透析器将聚合产物中大于1000×10³的成分除去，用100×10³膜堆去除聚合产 物中小于100×10³的成分，同时用生理盐水进行平衡。

2.32-羟基丙醛聚合方法同乙醇醛的聚合，但需加入适 量的对甲苯磺酸作为催化剂。采用7∶1，25∶1和40∶1 3个剂量。

2．4牛Hb聚合程度的检测

2.4.1不连续密度梯度SDS-PAGE取 7.5ml 0.38mol/L Tris-C l, p H8.8, 0.1%SDS溶液和7ml 30%丙烯酰胺-0.8%甲叉双丙烯酰胺（溶于前述溶液）用梯度发生 器于垂直板电泳槽中制备3%～30%的聚丙烯酰胺凝胶（分离胶）后，用3%丙烯酰胺-0.08%甲 叉双丙烯酰胺（溶于0.125mol/L Tris-Cl, pH6.8, 0.1%SDS溶液）制备浓缩胶。PolyH b样品用SDS上样缓冲液处理后，于100V电泳8h。电泳结束后用考马斯亮蓝染色。

2.4.2HPLC检测取少量聚合产物，用洗脱液稀释成 1mg/ml，于P ERKIN EL MER 235/200 HPLC仪（色谱柱为TSK－GEL G4,000SW）上检测聚合产物分子量分布 。用凝胶过滤高分子量校准试剂盒进行标定并绘制校准曲线。色谱条件：色谱柱 TSK－ GEL G4,000SW；柱温 20℃；洗脱液 1/15mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液，含0. 1mol/L NaCl；流速 0.5ml/min；紫外检测波长 280nm；进样体积：10μl。

2.5计算机分析模拟Hb聚合产物在蛋白质工作站上，采用 vuff.fvc力场，用分子力学方 法叠代1 000步，共计算20h，模拟了乙醇醛和2-羟基丙醛 于分子内交联和分子间聚合 产物体系的能量。

结果

1聚合反应结果

戊二醛聚合反应速度极快，反应达5h整个体系形成凝胶，所有Hb聚合成一个大分子。乙醇醛 聚合反应的速度较慢，但反应超过10h则形成凝胶。2-羟基丙醛聚合反应在3个剂量水平上 都能有效聚合，反应达到100h都未见凝胶形成，经检测，其中的高聚物也不多。

2Hb聚合程度的检测

2．1蛋白质相对分子质量标准HPLC所使用的TSK－GEL G4,000SW柱 的分离范围为10×10³～1 000×10³，蛋白质相对分子质量标准的HPLC洗脱曲线见图1， 由此绘制蛋白质相对分子质量校准曲线见图2。

图1TSK-GEL G4 000SW柱蛋白质相对分子质量标准洗脱时间

图2蛋白质相对分子质量标准曲线

2.2乙醇醛原始聚合产物及其超滤产物的洗脱曲线乙醇醛 聚合产物中有超过1 000×10³的大分子存在，它们被完全排阻，呈 9.12min处的洗脱 峰；此后小于1 000×10³的组分连续被洗脱出来并且数量不断增多， 在18.5min处形成一 个“肩”，此处的相对分子质量约为192×10³，即为α₂β₂的三聚体；随后在19.9mi n处形成最大的峰，此处的相对分子质量约为119×10³，即为α₂β₂的二聚体；在2 2.7min处出现第3个峰，此处的相对分子质量约为61×10³，应该是一个发生了分 子内交联的α ₂β₂；最后在25.2min处是一个“肩”，此处的相对<